褪黑素通过线粒体自噬抑制牛卵巢颗粒细胞凋亡机制

The apoptosis of granulosa cells induced by oxidative stress is the main reason of follicular atresia. Melatonin, as an antioxidant in follicle, can inhibit the apoptosis of granulosa cells by reducing the level of reactive oxygen species, while the mechanism is still unknown. Combined with our previous work and research progress in this field, it was found that melatonin inhibits apoptosis of bovine follicular granular cells, and mitochondrial transcription factor FoxO1 is involved in it. we believe that melatonin may inhibit mitochondrial autophagy by FoxO1 and its upstream signaling pathway, inhibiting the apoptosis of bovine granulosa cells induced by oxidative stress. This research take cattle ovarian follicle granulosa cells as the research object, using flow cytometry and Western blot and fluorescence quantitative PCR technique to study molecular biology of melatonin on the cattle ovarian granulosa cell apoptosis induced by oxidative stress and melatonin regulating role of mitochondrial autophagy, clarify the process of transcription factor FoxO1 involved in melatonin regulation of mitochondrial autophagy and its upstream signaling pathway, elucidate the mechanism of melatonin regulation of bovine ovarian granulosa cell apoptosis. The results are not only useful for revealing the regulation mechanism of follicular development, but also lay a theoretical foundation for the development and utilization of new bovine reproductive regulation technology.

氧化应激诱导的卵巢颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的主要原因，褪黑素作为卵泡中抗氧化剂通过降低活性氧水平进而抑制颗粒细胞凋亡，但其机制尚不清楚。结合我们前期工作和本领域研究进展，发现褪黑素可抑制牛卵泡颗粒细胞凋亡，并且线粒体转录因子FoxO1参与其中，故推测褪黑素可能通过FoxO1及其上游信号通路调节线粒体自噬而抑制氧化应激诱导的牛卵巢颗粒细胞凋亡。本项目以牛卵巢卵泡颗粒细胞为研究对象，利用流式细胞术、Western blot和荧光定量PCR等分子生物学方法研究褪黑素对氧化应激诱导的牛卵巢颗粒细胞凋亡和褪黑素对线粒体自噬的调节作用，明确转录因子FoxO1参与褪黑素调节线粒体自噬及其上游信号通路的过程，阐明褪黑素调节牛卵巢颗粒细胞凋亡的作用机制。研究结果不仅有助于揭示卵泡发育的调控机制，也为牛繁殖调控技术开发与利用奠定理论基础。

氧化应激诱导的颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的主要原因，严重影响了雌性动物的生殖功能和繁殖效率。褪黑素是机体可自身合成并分泌的一种内源性物质，具有抗氧化、抗凋亡等特性。褪黑素对颗粒细胞的氧化损伤具有保护作用，但机制仍有待阐明。线粒体自噬是一种选择性清除多余或受损线粒体的自噬过程，在调节细胞内线粒体数量和维持线粒体正常功能等方面发挥重要作用。氧化应激是触发线粒体自噬的因素之一。研究发现，褪黑素通过调节线粒体自噬减少外源性刺激或疾病引发的细胞损伤。此外，FoxO1是氧化应激发生时的主要转录调节因子，其活性受到SIRT1的调节。褪黑素可通过SIRT1/FoxO1调节多种细胞中的氧化应激和细胞凋亡。目前，线粒体自噬是否参与褪黑素对颗粒细胞氧化损伤的保护作用尚不明确，其内在的作用机制仍有待探究。.为了研究褪黑素对氧化应激诱导的牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响，通过流式细胞术、qRT-PCR和Western Blot等方法，检测凋亡相关蛋白和细胞死亡率，明确褪黑素能够抑制H2O2诱导的牛卵巢颗粒细胞凋亡；为了进一步明确褪黑素及H2O2对线粒体自噬的影响，通过Western Blot、线粒体自噬试剂盒等技术，检测线粒体自噬和凋亡相关指标及线粒体溶酶体融合水平，结果表明，褪黑素通过上调线粒体自噬抑制氧化应激诱导的牛卵巢颗粒细胞凋亡。.为了研究SIRT1在褪黑素调节线粒体自噬抑制细胞氧化损伤中的作用，通过Western Blot方法，检测了SIRT1的蛋白表达和线粒体自噬及凋亡相关指标；明确褪黑素通过SIRT1调节线粒体自噬抑制氧化应激诱导的牛卵巢颗粒细胞凋亡；为了进一步为了研究SIRT1/FoxO1在褪黑素调节线粒体自噬抑制氧化应激诱导的牛卵巢颗粒细胞凋亡中的作用，通过FoxO1过表达载体，通过Western Blot方法，检测线粒体自噬及凋亡相关指标，结果表明，SIRT1/FoxO1参与了褪黑素对线粒体自噬的调控作用及对牛卵巢颗粒细胞氧化损伤的保护作用。.本项目深入探讨褪黑素对颗粒细胞凋亡的保护机制，不仅有助于揭示卵泡发育的调控机制，还能为牛繁殖新技术的开发与利用奠定理论基础。