新型miRNA检测技术在冠状动脉疾病的风险预测、临床诊断和病情监测中的应用研究

Acute coronary syndrome（ACS）is one of the coronary artery diseases (CAD) affecting seriously human being. Unfortunately, current clinical examination methods are not suitable for risk evaluation and early diagnosis of ACS patients. There is an urgent need for advanced ACS detection and diagnostic methods. Based on our previous studies on rolling circle amplification (RCA) and DNAzyme detection, we will develop a novel method for highly sensitive detection of low-abundance nucleic acids. This method combines the advantages of easy operation at room temperature and dual-amplification of RCA and DNAzyme techniques. Furthermore, we will utilize this method to examine the miRNA quantities in a large number of clinical urine and circulating blood samples, make a comparison with clinical examination data (myocardial enzyme spectrum, cardiac troponin, ECG, coronary angiography) and clinical diagnostic results, establish correlations between different coronary cardiac diseases and miRNA quantities in urine samples and circulating blood samples, and identify the miRNA biomarkers capable for distinguishing different types of coronary cardiac diseases. This project will deliver an valuable information and advanced detection method for risk prediction, early warning and condition monitoring of ACS patients.

急性冠状动脉综合征是严重危害人类的常见冠状动脉疾病之一。但是现有的临床检验技术不仅无法对急性冠状动脉疾病患者进行风险预测和早期预警，也无法在第一时间内对突发的急性冠脉综合征进行确切诊断。本课题将在前期工作的基础上，进一步优化滚环扩增技术和DNAzyme的酶促化学发光技术，充分利用它们在常温下检测的简便性和双重放大的高灵敏度，开发出可以检测低丰度核酸的高灵敏度核酸检测技术。利用该技术检测大样本量的临床尿样和血样的miRNA，通过与传统临床检验指标（心肌酶谱、心肌钙蛋白、心电图、冠状动脉造影）和确切诊断结果的对比分析，建立不同冠状动脉疾病与尿样和外周血中miRNA表达量的关联性，筛选出可以鉴定出不同冠状动脉疾病（特别是急性冠脉综合征）的尿样和血样中的miRNA诊断标志物，为急性冠状动脉疾病的风险预测、早期预警和病情监测提供重要的检验指标和先进的诊断技术。

本课题针对目前临床诊断的迫切需求和现有核酸检测技术的弊端，提出了利用新型恒温扩增技术改善核酸检测性能的设想。我们将关注点聚焦在滚环扩增（rolling circle amplification，简称RCA）。首先我们系统地研究了核苷酸衍生物对滚环扩增效率的影响、不同连接酶对制备锁式探针（padlock probe）的环化效率的影响、核苷酸衍生物对G-四链体结构稳定性的影响、G-四链体的结构特性与DNAzyme的酶促显色的相关性、利用胶体金纳米颗粒对滚环扩增产物和指数扩增（EXPAR）产物实施新型裸眼可视化检测。基于这些研究的实验结果和结论，我们开发了新型的核酸检测方法。该方法具有灵敏（检测限可以达到2.219zmol的量级）、精准（可以特异性地区分出仅有单个核苷酸差异的寡核苷酸靶分子）、便捷（样品制备方便、操作方便、结果显示方便）、高效（不需要价格昂贵的精密检测仪器）、快速（20分钟 ~ 30分钟即可获得检测结果）和实时（可以开展现场的POCT检测）的技术优势。这种新方法可以成为常规临床诊断分析中的超灵敏核酸检测、生物学以及基础医学研究中的基因组检测、实时实地海关检验检疫、公共卫生监测、法医现场标本分析的一种极有价值的工具。.在此基础上，我们又开拓了该项新技术的应用领域。在后基因组时代和蛋白质组学时代，蛋白质之间的相互作用以及蛋白质与核酸之间的相互作用是解析物种进化、探索疾病起源、延长生命极限、保障人类健康的基本问题和关键技术。现有的方法和技术都有不同的优缺点，为了实现快速检测、高通量筛选和全基因组挖掘的目的，我们充分利用了蛋白质在与核酸相互作用时的变构效应，开发出了基于滚环扩增技术的新方法。应用该项新技术，我们已经成功地研究了核酸内切酶在切割核酸链过程中的动力学特性，检测了与新生儿代谢病相关的氨酸，构建了生物逻辑门元件等，填补了经典研究方法的不足，为开发具有自主知识产权的新型核酸检测技术和生物大分子相互作用的研究方法奠定了坚实的实验基础。