基于细胞的两阶段培养体系解析紫草药用天然产物合成的分子触发机制

紫草细胞的两阶段培养体系可快速触发具有重要药用价值的天然产物-紫草宁的大量合成【在B5培养基中不产生紫草宁，转接至M9培养基中大量产生紫草宁】，然而此触发过程的分子机制还知之甚少。结合我们前期的工作基础及预研结果，本项目拟基于细胞的此两阶段培养体系，综合功能蛋白质组学【2DE+质谱分析+功能注释】和功能基因组学【SSH文库构建+个性化芯片点制+杂交分析+基因功能注释】研究结果，协同解析两阶段培养体系触发紫草细胞从初生代谢→次生代谢转变所可能必需的物质能量转变途径、蛋白/基因分子调控机制，预测与紫草宁触发合成相关的重要靶标蛋白/基因，并进而通过蛋白-蛋白、蛋白-基因、时空表达分析、转基因功能分析(OE+RNAi)等发掘可应用于紫草生物工程实践的关键靶标蛋白/基因，获得高产紫草宁转基因毛状根株系。该项目的完成可为深入揭示紫草宁合成调控的分子机制，以及非模式植物的次生代谢生物工程实践奠定基础。

紫草作为一种传统的药用植物，其根系可合成具有重要药用价值的次生代谢产物-紫草宁及其衍生物。紫草细胞/毛状根的两阶段培养体系可快速触发这些化合物的大量合成【在B5培养基中不产生紫草宁，转接至M9培养基中可大量触发紫草宁的合成】，然而此触发过程的分子机制还知之甚少。. 本项目以紫草细胞和毛状根为材料，基于该两阶段培养体系发掘了在紫草宁合成触发过程中起到重要调控作用的关键靶蛋白/基因，并通过转基因策略解析了其调控效应和分子机制，获得了几个高产紫草宁的转基因毛状根株系，为商业化生产紫草宁提供了优良的材料基础。本项目研究结果为深入揭示紫草宁合成调控的分子机制，以及非模式植物的次生代谢生物工程实践奠定了基础。. 主要结果概述如下：(1) 通过蛋白质组学技术解析了两阶段培养体系触发紫草宁合成的蛋白质动态表达谱，并发掘了一些关键蛋白。(2) 解析了两阶段培养体系触发紫草宁合成过程中2,4-D的调控效应及作用机制。(3) 通过高通量转录组测序技术解析了两阶段培养体系触发紫草宁合成的基因网络代谢途径分子机制，并发掘了一些关键调控基因。(4) 通过转基因策略（Overexpression和RNAi）深入解析了关键调控基因LeMYB1、LeMYC和LeEIL-1对紫草宁合成的调控效应和分子机制。(5) 通过酵母单杂交和酵母双杂交技术探讨了LeTCP2/AtTCPs与SCL29间的相互作用关系。(6) 基于关键差异蛋白和基因的功能分析，从物质和能量代谢及蛋白/基因表达调控层次探讨了两阶段培养体系触发紫草宁合成的分子机制。(7) 获得了几个高产紫草宁及其衍生物的转基因毛状根株系。(8) 目前已发表SCI论文6篇，中文期刊论文3篇，会议论文10篇。(9) 申请4项发明专利。