磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的定向进化和催化机制研究

磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（PCK）是丁二酸合成途径中的关键酶之一，经由PEP羧化激酶(PCK)催化的反应伴有ATP的生成，理论上更有利于菌体生长和产酸，但大肠杆菌中PEP羧化激酶是糖异生酶，只有在补充大量CO2或高浓度HCO3?时才能起作用，这限制了PEP羧化激酶在大肠杆菌产酸途径中的作用。本研究拟用DNA shuffling技术与进化代谢工程相结合，定向进化能在大肠杆菌中高效催化产丁二酸的PEP羧化激酶，并进一步研究PEP羧化激酶的高效产酸机制。通过本研究，不仅可以为产丁二酸高产菌株构建提供新的突破点，同时也为CO2固定酶类的催化机制研究提供原材料和理论基础。

丁二酸又称为琥珀酸，可以作为多种化合物的合成前体，被广泛应用于食品、药品、可降解塑料的合成等多个领域，被美国能源部认为是12种最具价值的生物基大宗化学品之一。目前丁二酸主要通过化学法合成，而利用Escherichia coli发酵生产丁二酸以其能耗低、污染小等优点引起了科学家们的极大关注。.PEP羧化是丁二酸合成过程中的重要一步，经由PEP羧化激酶(PCK)催化的反应伴有ATP的生成，理论上更有利于菌体生长和产酸。但大肠杆菌的PEP羧化激酶对HCO3-的亲和性很差，只有在高浓度HCO3-才能起作用，这限制了PEP羧化激酶在大肠杆菌产酸途径中的作用。本项目在构建底盘菌株的基础上，主要研究以下三项内容：（1）建立PCK酶高通量筛选方法。比较了代谢进化和固紫B盐筛选方法，认为代谢进化方法简单快捷，但存在宿主细胞突变积累引起优良突变丢失的现象。固紫B盐法虽然筛选工作量稍大，但目标针对性强，避免菌体其他位点突变带来的不利影响，更容易筛选到酶活提高的PCK突变体。（2）分析了突变体的催化性质与结构功能之间的关系，发现了一个重要位点Leu265，一个突变体只有一个突变位点Leu265Met，另一个突变体M4也在该位点发生突变Leu265Pro，该突变体对底物HCO3-的亲和力提高；通过蛋白质结构同源建模和底物分子对接分析发现，该位点位于一段连接N-端结构域和C-端结构域的一个loop环中，该loop环处于活性口袋的底部，与周围的催化残基Ser250，Lys254，Thr255，Asp269距离较近，因此该loop环上的残基突变虽未能与底物分子发生直接的相互作用，但会间接影响到活性口袋与底物分子的相互作用及空间位阻。（3）研究了PCK与PPC协同作用对丁二酸产量的影响。发现在一定范围内提高PPC酶活有利于丁二酸的合成，但是过高活性的PPC酶（≥0.47U/mg）将会导致ATP能量的大量损失，继而降低菌株的生长和丁二酸的生产。协同利用PCK和PPC，能够充分发挥各自催化优势，比利用单个酶更有利于丁二酸的合成。.本项目开发了快速、有效的PCK酶高通量筛选方法，为筛选到PCK优良突变奠定了良好基础；研究发现E. coli中PEP羧化酶（PPC）和PEP羧化激酶（PCK）协同作用，可以利用各自优势，提高丁二酸生产。本项目共发表SCI收录论文2篇，申报发明专利2项。