云南三个少数民族感染的HBV病毒基因异质性及进化动力学研究

高度核酸变异和由此造成的基因异质性是乙肝疾病进程及药物应答差异的主要原因。本项目拟在前期发现的云南边境少数民族HBV自然疫源区，选择孤立村落少数民族及当地城镇人口为观测对象，通过1）两对半指标确定HBV感染率及携带率2）对现时段样本，进行HBV 基因序列分析，确定主要流行基因型及其变异特点，发现新的基因型/亚型/重组型，阐明HBV基因异质性；3）密码子置换模式研究，明确病毒的选择压力及可能的阳性选择位点，为治疗和药物研发提供靶点4）通过同源性比较和进化分析，明确主要流行基因型的进化特点，推测其传入时间、来源地点，并科学预测云南少数民族HBV 基因型分布的变化趋势及其对全国HBV 传播与流行的影响。本研究把常规HBV 病毒核酸序列分析技术与"朔祖"理论及"进化分子钟"分析方法相结合，将从"现时"HBV基因异质、"历史"传播行为和"将来"流行趋势等不同层面，为云南省乙型肝炎的防控提供理论依据。

本研究采用整群随机抽样的方法，选取云南西南边境傣族、哈尼族及瑶族共5个孤立村落及2个附近城镇民族村落909份血清样本，检测乙型肝炎病毒的血清标志物，HBsAg阳性样本进行HBVDNA直接或/及克隆测序,使用DNAStar、BioEdit、Clustal X、MEGA 5、BEAST、FigTree、NETWORK及PHYLIP等软件进行种系进化、动力学、基因异质性及选择压力分析。使用SPSS软件进行统计处理。结果显示，1）三个少数民族HBsAg阳性携带率为17.1％,其中，城镇人口HBsAg阳性携带率及感染率都显著高于孤立山村人口。HBsAg、HBeAg、HBeAb及HBcAb阳性率在不同民族及不同年龄组间有差异。2).该地区流行的基因型为C、B及I三种类型； C1/C2、B2/B3及I1/I2基因亚型S基因序列分别存在8、3及5个特异核苷酸差异分布，瑶族B3基因亚型有5个特异性位点；该地区主要流行HBV C基因型仅有16种S基因序列。3）构建的B、C、I基因型HBV重组质粒瞬时转染HepG2细胞后可检测到HBsAg表达；针对α-1b抗病毒作用， B型具有持续应答效应；I型、C型有短暂的前期应答效应。4) 在松弛分子钟模式下，各亚型最近共同祖先分别约为C1亚型21年前、C2亚型30年前、B2基因亚型62年前、B3亚型50年前、I型为30年前。贝叶斯天空曲线分析显示，HBV/C在20世纪60年代中后期至70年代中早期有过快速传播，之后呈平稳趋势；HBV/B在最近共同祖先株分歧后前10年迅速降低，之后的20年间呈平稳缓慢增长的趋势；HBV/I基因型在20世纪80年代亚洲有过快速传播流行。5）HBV读框中，P基因处于正选择压力状态，前S区NTCP受体序列nt84位点为正选择位点。免疫耐受组较免疫清除组有多个区域存在阳性选择位点。6）中国及周边14个国家HBV流行基因型分布存在地区差异；FJ386674可能是假设的B10亚型。由此阐明： 1)该地人群HBsAg(+)携带率高于全国平均水平；2) S基因序列具有亚型及地区特异性。3）；不同HBV基因亚型对α-1b应答时效有差异。4）战争及改革开放可能是导致HBV流行及传播的主要原因。5) HBV阳性选择位点在治疗药物的开发时具有潜在价值。6）明确中国及周边国家流行的基因型及亚型在疫苗的开发及HBV防控上有重要意义。