苯并[a]芘诱导细胞恶性转化过程中DNA聚合酶β表达水平改变的表观遗传学机制研究

申请者在前期研究中发现，苯并[a]芘（BaP）诱导细胞恶性转化过程DNA聚合酶β（polβ）的高表达参与了基因组遗传不稳定性，与肿瘤的发生发展密切相关。然而目前关于BaP诱导恶性转化过程中polβ表达水平的调节机制尚未见报道。DNA甲基化和蛋白精氨酸甲基化修饰是表观遗传学研究的重要方向，分别由DNA甲基化转移酶(Dnmts)和蛋白精氨酸转移酶(PRMTs)催化完成，在基因表达调控中发挥着重要作用。本研究拟以BaP诱导的恶性转化细胞为模型，分析BaP诱导细胞恶性转化过程中polβ、Dnmts及PRMT6的表达水平，polβDNA甲基化和蛋白精氨酸甲基化状态，以及Dnmts和PRMT6对polβ表达的调控，探讨表观遗传学机制在调节polβ表达水平中的作用，为深入研究BaP致癌的分子机制提供更多的实验依据，并为适度调节polβ的表达水平，防止环境致癌物诱导的肿瘤发生发展提供新的思路。

为明确BaP诱导细胞恶性转化过程中pol β的变化规律，阐明表观遗传学机制在调节pol β表达水平中的意义，为深入研究BaP致癌的分子机制提供更多的实验依据。本研究通过低剂量长期多次染毒的方式成功建立了BaP诱导恶性转化的细胞模型（pol β-T），对恶性转化过程中pol β的表达进行分析，结果显示pol β-T细胞中pol β mRNA和蛋白表达水平分别高达对照细胞的3倍和2倍；通过分子生物学手段对蛋白精氨酸甲基化相关基因PRMT6基因和蛋白的表达水平进行分析，发现pol β-T细胞中PRMT6的表达水平显著增加，其mRNA和蛋白表达水平分别为对照细胞的1.5倍和3倍；采用siRNA技术抑制恶性转化细胞中PRMT6基因的表达并观察其对pol β表达水平的影响，结果发现转染PRMT6基因siRNA的恶性转化细胞中polβ蛋白及mRNA表达水平亦明显下降，降幅高达50%；对DNA甲基化转移酶Dnmts的表达水平进行检测，并采用重亚硫酸盐转化后基因测序等方法对polβ基因启动子的甲基化水平和DNA甲基转移酶活性进行研究，发现恶性转化细胞中Dnmt1和Dnmt3b的表达水平显著高于对照，Dnmt3a的表达量在两者间无明显差异，polβ基因启动子的甲基化水平亦无显著变化，但在恶性转化细胞中DNA甲基转移酶的活性则明显低于对照组；通过染色质免疫共沉淀与荧光定量PCR相结合（CHIP-qPCR）等方法对恶性转化细胞polβ基因启动子区域组蛋白H3、H4的乙酰化水平和去乙酰化酶活性进行了定量研究，结果发现恶性转化细胞去乙酰化酶活性显著低于对照组，而polβ基因启动子区域附近乙酰化组蛋白H4富集倍数远高于对照组。上述结果阐明了BaP诱导细胞恶性转化过程中pol β表达水平增高的规律，揭示了BaP诱导的pol β表达水平变化由蛋白精氨酸甲基化调控的机制，DNA甲基化转移酶的表达量与pol β表达水平的增高间虽无直接关联，但可通过酶活性的降低诱导基因组低甲基化从而影响polβ的表达，同时，提示组蛋白乙酰化亦可能是BaP诱导的恶性转化过程中polβ基因表达水平改变的调节机制之一。