两类植物抗菌肽氧化重折叠机制及影响因素的比较研究

富含半胱氨酸蛋白的氧化重折叠研究是解决蛋白质折叠这个生命科学热点问题的必经之路。本项目选择了两类含有8个半胱氨酸的硫素类抗菌肽alpha1-purothionin和Gcthionin进行比较，前者来源于小麦，属于模式蛋白，后者是从本实验室构建的手掌参cDNA文库中筛选获得的一类新型植物防御素。在前期原核表达、Western blot鉴定、纯化获得目标蛋白的基础上，本项目拟通过酸处理、反相HPLC、质谱、核磁、圆二色、荧光、拉曼等手段研究这两类抗菌肽的氧化重折叠机制，揭示天然结构、非天然结构的中间体在折叠过程中的作用。并在Blast序列比对、蛋白二级结构预测等软件分析的基础上，对蛋白特定区域的氨基酸残基进行理性突变，研究不同蛋白突变体的折叠途径、折叠动力学、产物结构及功能是否存在差异。相关研究旨在丰富蛋白质折叠理论，同时为寻找不同硫素类抗菌肽之间的关联及实现它们的相互转化提供有意义的指导。

富含半胱氨酸蛋白的氧化重折叠研究是解决蛋白质折叠这个生命科学热点和难点问题的必经之路。本项目选择了1个含有8个Cys的抗菌肽Gcthionin和1个含有12个Cys的个GcGASA进行研究, 我们围绕这两类蛋白的原核表达、一系列突变体构建、生物活性方面开展了大量的工作，包括：（1）对于GcGASA蛋白，在采用pET-28(a)作为原核表达载体，构建野生型重组质粒的基础上，采用定点突变技术构建了10个CysSer突变体，并对其抗氧化、抗菌活性进行了研究，发表了两篇SCI文章；（2）对于新型植物防御素Gcthionin，采用pET-32(a)作为原核表达载体，进行了原核表达、亲合层析，酸切割及HPLC的研究，并检测了其抗真菌活性，发现融合蛋白及合成的多肽均等能抑制禾谷镰刀菌孢子萌发；另外，通过定点突变技术构建了多个理想的突变体，完成了预期的部分工作，解决了氧化重折叠最重要的样品问题。对于具体的氧化重折叠工作，我们从GcGASA包含体入手，采用稀释、透析、柱上复性等方法摸索了氧化重折叠的条件，并借助酸处理，反相HPLC初步观察了氧化重折叠过程，结果发现重折叠产物与去折叠蛋白的疏水性质非常接近，其流出时间差异较小，目前尚在对各种重折叠条件及影响因素进行优化，以期获得更好的结果。