Parkin在Cr（VI）致鸡肝细胞线粒体自噬中的调控及机制研究

Previous studies showed that long-term accumulation of heavy metal chromium can induce intracellular mitophagy, leading to liver injury in poultry. It has been confirmed that intracellular mitophagy pathway mediated by Parkin is closely related to hepatocyte injury. However, the exact relationship among Cr(VI), Parkin protein and mitophagy of hepatocyte has not been reported. This study will utilize transmission electron microscopy (TEM), flow cytometry, transcriptome, proteome, co-immunoprecipitation, qRT-PCR and bioinformatics methods to determine the correlation between hepatocyte mitophagy induced by Cr(VI) and Parkin protein in chicken. Through the establishment of Parkin protein knockdown and site-directed mutagenesis cell model on chicken hepatocytes we can evaluate the Parkin related transduction pathways and target protein in hepatocyte mitophagy process induced by Cr(VI). Then we will illustrate the signalling transduction pathway and regulation mechanism of Parkin in hepatocyt mitophagy induced by Cr(VI). This study aims to provide theoretical and experimental basis for comprehensively understanding the pathogenic mechanism of heavy metal chromium poisoning and exploring new targets for prevention of heavy metal chromium poisoning.

本团队前期研究发现机体长期积累重金属铬能够引起细胞线粒体自噬，导致禽类肝脏损伤。已有研究证实，Parkin介导的细胞线粒体自噬通路与肝细胞损伤密切相关。但Cr（VI）、Parkin以及肝细胞线粒体自噬三者确切联系及作用机制还未见报道。本项目拟通过透射电镜、流式细胞术、组学技术、免疫共沉淀、qRT-PCR、生物信息学等方法，在测定Cr（VI）致鸡肝细胞线粒体自噬与Parkin蛋白相关性的基础上，以鸡肝细胞为研究对象，建立Parkin沉默/定点突变细胞模型，对Cr（VI）致鸡肝细胞线粒体自噬过程中Parkin基因参与的信号转导途径及其靶蛋白进行检测，解析Parkin在Cr（VI）导致的肝细胞线粒体自噬中的信号转导通路及其调控机制。为全面认识重金属铬中毒的致病机理、探寻重金属铬中毒的防控新靶点提供理论和试验依据。

本团队前期研究发现机体长期积累重金属铬能够引起细胞线粒体自噬，导致禽类肝脏损伤。已有研究证实，Parkin介导的细胞线粒体自噬通路与肝细胞损伤密切相关。但Cr（VI）、Parkin以及肝细胞线粒体自噬三者确切联系及作用机制还未见报道。本课题使用鸡肝原代细胞构建Cr（Ⅵ）中毒的体外模型，通过Western Blot检测自噬相关蛋白LC3和p62的表达量并进行定量分析，筛选出Cr（Ⅵ）的最佳处理时间和浓度。通过Western Blot检测线粒体自噬相关蛋白Parkin、LC3和p62的表达量并进行定量分析；通过ELISA检测PINK1的表达量并进行定量分析; 以及通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测线粒体膜电位（MMP）的变化和活性氧（ROS）的产生，验证Cr（Ⅵ）可以造成鸡肝原代细胞线粒体的损伤并激活线粒体自噬。随后，为了进一步探讨Parkin在Cr（Ⅵ）诱导的鸡肝细胞线粒体自噬中的作用，本实验使用siRNA构建Parkin沉默的鸡肝癌细胞（LMH）模型，通过流式细胞术和Western Blot验证Parkin被有效地沉默。通过Western Blot检测线粒体自噬相关蛋白Parkin、p62和LC3的表达量并进行定量分析；通过ELISA检测PINK1的表达量并进行定量分析；通过激光共聚焦显微镜观察线粒体形态变化；通过激光共聚焦显微镜技术和流式细胞术检测MMP的变化和ROS的产生，进一步阐明Parkin在 Cr（Ⅵ）诱导的线粒体自噬中的作用。本课题解析了Parkin在Cr（VI）导致的鸡肝细胞线粒体自噬中的信号转导通路及其调控机制，为全面认识重金属铬中毒的致病机理、探寻重金属铬中毒的防控新靶点提供理论和试验依据。