沟叶结缕草耐盐相关液泡膜H+-焦磷酸酶基因克隆、表达及功能研究

盐碱地改良已上升为国家战略，市场上迫切需求高度耐盐草坪草进行盐碱地区草坪建植。在前期结缕草属耐盐资源筛选及分子标记研究的基础上，本项目拟进行以下研究：1）以高度耐盐的沟叶结缕草为材料，克隆耐盐关键基因I型和Ⅱ型液泡膜H+-PPase基因（ZmVP1，ZmVP2），为进行结缕草属特异基因改良提供靶标；2）以两类极端耐盐的沟叶结缕草品种（系）为材料，进行盐胁迫处理，分析比较ZmVP1和ZmVP2基因的时空差异表达；3）采用农杆菌介导法分别将ZmVP1和ZmVP2基因转入盐敏感的假俭草，比较盐胁迫下转基因植株和对照植株中ZmVPs基因的酶活性、离子浓度、和相关渗透调节物质的含量，验证ZmVPs基因的功能，比较两类ZmVPs基因参与调控盐胁迫的作用机理及功能差异。本研究的开展，可明确两类液泡膜H+-PPase在盐胁迫中的作用，为培育具有自主知识产权的耐盐草坪草新品种提供了重要靶标和良好的实验基础。

结缕草属植物是优异的多年生暖季型草坪草，在世界范围内广泛应用，具有极强的抗盐性；开展结缕草属植物抗盐分子机制的研究，对指导草坪草抗盐育种具有重要意义。本项目建立在前期对结缕草属植物抗盐评价和生理机制研究的基础上，以极端抗盐的沟叶结缕草‘Z123’为材料，克隆了两个候选抗盐基因ZmVP1和ZmVP2，分析了其在盐胁迫下的表达特性；进一步通过异源转化酵母、拟南芥和假俭草，验证其抗盐调控机制。研究结果显示：（1）通过同源克隆和RACE方法，从沟叶结缕草中获得了1个ZmVP1亚家族基因（全长2797bp，编码768aa，NCBI登录号：KP280174）和2个ZmVP2亚家族基因（ZmVP2-1全长3156 bp，编码709aa；ZmVP2-2全长3052bp，编码799aa）；（2）荧光定量分析发现，盐胁迫条件下，两个沟叶结缕草品种（高耐盐‘Z123’和低耐盐‘Z014’）的ZmVP1和ZmVP2的表达存在明显差异；（3）转ZmVP1基因显著提高了酵母和拟南芥假俭草抗盐性，而转两个ZmVP2基因未能提高其抗盐性。进一步研究发现，转ZmVP1基因显著提高了拟南芥植株叶片中Na+和K+离子含量，促进了V-ATP酶和V-PP酶活性的增加，促进了Na+ 离子转运基因NHX、渗透调节基因P5CS和LEA、抗氧化基因SOD和APX的表达；（4）进一步优化了假俭草转基因体系，并以此体系转化了ZmVP1基因，初步获得了7个ZmVP1转基因株系，通过在盐培养基中的表型观测，发现ZmVP1转基因株系表现出较低的枯黄率和较高的生物量，同时发现转ZmVP1基因假俭草株系表现出更低的Na+积累和较高的K+含量。这些结果表明，ZmVP1基因提高抗盐性的机制一方面通过建立细胞质与液泡间的H+电势差，驱动Na+转运到液泡中，减轻细胞质内Na+的积累，同时维持较高的K+稳定性；另一方面能促进了离子代谢、渗透胁迫和抗氧化相关基因的表达。通过本项目的实施，不仅明确了结缕草属植物中VP家族基因的抗盐机制，同时为其它草坪草抗盐分子育种提供了优异可靠的基因资源。