三角梅核糖体失活蛋白在作物抗病虫害中的功能研究

Ribosome inactivating proteins (RIP) attract much attention because of their wide spread, diverse biological activities and the huge application potential for medicine or agriculture.Among the RIP, bouganin is proved to be the one who has the lowest toxicity. Our previous researches on Bouganinvillea glabra Choisy showed that several homology RIP gene sequences can be cloned and that transgenic plants of two randomly selected cloned sequences are resistant to aphid, ant and Botrytis Cinerea. So we think it is very meaningful to clone the entire corresponding genomic sequences and cDNA sequences for illuminating the polymorphism and control methods of bouganin RIP aided by bioinformatics and gene transformation. Inaddition, we prepare to extract bougain RIP proteins from plant by affinity chromatography to find out their polymorphysim, structural charateristics and biological activities with protein sequence analysis and bioinformatics. By matching the gene information and protein information, we can further modify the bouganin genes or use inducible promoters for gene tansformation to explore the application strategies and effects. We wish this project can promote the understanding and utilization of RIP proteins and their gene resources.

核糖体失活蛋白因其广泛的分布、对植物病虫害的广谱抗性以及抗肿瘤等生物活性，在农业和医学上有着重大的应用潜力。三角梅核糖体失活蛋白被认为是目前所发现的对动物细胞和个体毒性最低的核糖体失活蛋白，意味着它具有更高的应用价值。前期我们从厦门光叶三角梅中克隆到多条核糖体失活蛋白基因的同源序列，其中两条序列的转基因植物表现多种抗作物病虫害功能。在本项目中，首先拟进一步对已克隆的序列进行基因组水平及转录水平的序列全长分析，了解序列多态性的性质及成因、确定相关基因特异性表达及调控特征。第二，通过亲和层析等方法直接从植株分离纯化核糖体失活蛋白，详细了解蛋白的多态性、生物活性、蛋白质序列与结构特征及活性机理。最后，整合基因信息与蛋白质信息，开展基因改造及利用诱导型启动子载体进行转基因，探讨其实践应用策略和效果，为更好地认识和利用三角梅核糖体失活蛋白及其基因资源奠定基础。

核糖体失活蛋白RIPs具有抗肿瘤、抗艾滋病毒等活性，同时具有对多种植物病虫害的广谱抗性。随着越来越多的RIPs在高等植物和其他少数生物中不断被发现，RIPs的生物学功能、作用机理等基础研究受到了广泛关注，其实践应用研究也逐渐开展。三角梅核糖体失活蛋白Bouganin据报导为目前所发现的毒性最低的核糖体失活蛋白，无疑具有更高的应用潜力，而对其基因和蛋白特征特性的充分了解，是RIPs的基础研究的重要组成部分。本项目以光叶三角梅(Bougainvillea glabra choisy)为材料，进行了Bouganin基因和蛋白的分析，同时进行了bouganin基因的植物转化，观察转基因植物的抗病虫特性。研究共获得24条基因序列，所有序列同源性为70-99%。对序列的5’, 3’非编码区的分析发现，Bouganin基因3’末端序列存在较高的多态性，而其5’末端序列却表现出高度的一致性；预测氨基酸二级和空间结构发现，虽然Bouganin的DNA和氨基酸序列有明显的不同，但其空间结构却没有明显的差异。将克隆的Bouganin基因序列进行原核体外表达，纯化表达蛋白并制备多克隆抗体后，通过免疫亲和层析技术分离三角梅天然蛋白，实验共获得4种Bouganin蛋白异构体，丰度和种类在叶片、花和苞片中具有一定的差异。另外，转Bouganin基因的植物的抗病虫分析表明不同基因片段的转基因植株的抗病虫水平均得到显著提高，但不同基因片段的转化植株对不同病虫害表现一定差异。转基因植株的抗病虫差异可能与不同Bouganin蛋白的抗病虫活性相关，也可能与外源基因的插入位点相关。本研究发现Bouganin基因和蛋白在同一物种中的多态性与其他植物中发现多态性的RIPs的结果相一致，而且多态性水平比目前所有报导更高，因此推测RIPs的多态性可能广泛存在，但由于研究热点和同源蛋白分离技术等现实的原因而尚待进一步的发掘和证实。另一方面，RIPs的多态性表明它可能为一个基因家族编码，除了抗病虫特性以外，可能担负更多的生物功能。转基因植物的研究则进一步证明RIPs在植物抗病虫育种中的意义，作为一个具有广谱抗病虫害的基因资源所具有的巨大潜力。本研究获得的转基因植物亦可进一步筛选培育作为重要的抗病虫品种选育的经济品种利用。