基于NLRP3炎症小体探讨NF-κB通过调控小胶质细胞极化影响阿尔茨海默病变的分子机理研究

The growing emphasis on immune inflammatory response may place more responsibility on the process of Alzherimer’s disease (AD). Specifically, the production and deposition of β-amyloid protein (Aβ) activate microglial cells (MG) in the brains of AD patiens, which results in production pro-inflammatory or anti-inflammatory M1- or M2-depentent manner. Our previous works showed that activation of NF-κB pathway may be involved in the deposition of Aβ. However, the mechanisms are not clear. As the critical roles of nod-like receptor protein 3 (NLRP3) inflammasome in microglia polarization, which resulted in the increasing the deposition of Aβ in the APP/PS1 transgenic mice. By using flow cytometry, confocal microscopy, Western Blot, RT-PCR and Biomarker system on NLRP3 inflammasome or NF-κB knock-out mice and co-cell culture, we plan to identify the role of NF-κB-NLRP3 inflammasome on microglia polarization in AD pathophysiological process, beside, we will use NF-κB inhibitor or caspase-1、IL-1, IL-18 inhibitors and M2 cell in vivo or vitro experiment to verfy our hypothesis. This project will reveal the new mechanism that NF-κB-NLRP3 inflammasome in inflammatory reactions in AD, and provide new ideas and potential therapeutic targets for the treatment of AD.

AD是临床最常见的神经退行性疾病，但目前尚缺乏有效的治疗手段。现有研究表明，免疫炎症反应及小胶质细胞（MG）在AD的发病中起到重要作用。我们前期研究发现，M1型细胞分泌的细胞因子可刺激神经元内β-淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）沉积，且与NF-κB活化相关，目前有研究认为NF-κB是NLRP3炎症小体预激过程中促进NLRP3相关蛋白及前体蛋白表达的总开关，同时NLRP3炎症小体活化后可引起M1型细胞的激活，说明NF-κB-NLRP3炎症小体-MG极化三者间存在密切关系。本课题拟在既往研究基础上，在体外细胞培养中应用流式分选、BioMark、免疫荧光等技术，研究NF-κB通过NLRP3炎症小体途径调控MG细胞极化在AD发病中的作用；通过分析NF-κB和NLRP3炎症小体表达情况，应用基因敲除鼠建立AD模型，并干预NF-κB及NLRP3炎症小体下游信号分子，寻找AD可能的治疗靶点。

背景：海人藻酸（KA）在多种动物模型中可导致学习及记忆功能损伤，可以选择性的引起啮齿类动物脑内不同区域神经元的兴奋性中毒，从而模拟AD病人中枢神经系统内的病变过程。炎症小体在AD病变进展中起关键作用，然而其具体机制尚不清楚。.主要研究内容：使用转基因小鼠，给予KA处理后，使用行为学实验评估小鼠的认知功能变化。收集不同组间小鼠标本使用免疫组化和双重荧光染色的方法观察Aβ、NF-κB和NLRP3炎症小体的表达情况。在体外培养中使用Grik1-3，KA1-2，IL-1β和BDNF等抗体抑制相关因子表达，将标本收集后检测NF-κB、p-NF-κB，NLRP3等相关因子的表达量。.结果及数据：1、KA可激活NLRP3和NF-κB，并进一步诱导IL-1β和BDNF表达的上调。使用NLRP3和NF-κB的抑制剂Bay11-7082后，可以导致KA产生的NLRP3和BDNF表达量降低。在实验中敲除KA受体Grik1和Grik3的表达后会减少NLRP3和NF-κB的表达。表明KA受体可以通过上调NLRP3和NF-κB的表达量从而影响KA调控IL-1β和BDNF表达水平的功能。.2、与BDNF相比，IL-1β激活BACE1的能力更强，并且可进一步产生Aβ，同时可以通过使用Bay11-7082来抑制该功能，从而减少KA诱导的小鼠脑内Aβ的表达量及减轻小鼠的行为学损伤程度。.3、KA在MAPT转基因小鼠脑内可造成tau蛋白的持续性磷酸化。同时在小鼠脑内和体外的小胶质细胞培养过程中，我们均发现了加入KA后可导致内质网应激出现，主要表现为内质网的主要标志物ATF6, GRP78和IRE1均被激活，并进一步造成炎症小体的活化。同时KA受体可参与KA导致的内质网应激过程。内质网应激可通过激活炎症小体的两个主要组成部分NLRP3和NF-κB来进一步活化炎症小体，最后可产生IL-β。IL-1β表达量与tau蛋白的磷酸化程度成正相关，该表达同样可被Bay11-7082抑制。.科学意义：KA诱导的神经元损伤可通过NLRP3炎症小体诱导的NF-κB信号通路实现。NLRP3炎症小体可能成为发挥神经保护和干预AD疾病进程的潜在治疗分子。同时在KA诱导的动物模型中，使用抑制剂Bay11-7082可通过抑制炎症小体的表达来发挥抗神经元变性、Aβ沉积和记忆损伤的作用。