喉粘膜固有层多能干细胞的鉴定及促进声带损伤的研究

声带疤痕由于声带固有层缺失，导致声门闭合不全，出现发音困难和误吸等症状，影响患者的生活质量。其治疗已成为嗓音外科研究的热点和难点。目前干细胞治疗声带疤痕取得一定进展，但仍存在取材及组织来源差异较大等问题。喉粘膜范围广泛，与声带组织来源一致、结构相近，声带外粘膜取材方便、不留疤痕、不影响发音。我们在前期工作中已证实喉粘膜固有层存在多能干细胞。本申请课题将进一步对单克隆喉粘膜固有层干细胞进行生物学特性分析，并在体外培养环境下，通过定向诱导分化和细胞共培养技术，观察喉粘膜固有层多能干细胞的定向分化能力。已有研究证明，单纯干细胞植入修复效果不佳，植入细胞需复合在支架材料。脱细胞真皮基质具有无细胞免疫性、降解速度可调控等特点，将其制备成可注射性微粒，通过生物旋转反应器，构建含干细胞的微粒，注射并修复声带固有层缺损组织，评价喉粘膜固有层干细胞修复声带缺损的效果，为临床治疗声带疤痕提供新的思路和方法。

声带疤痕、声带萎缩一直是困扰嗓音外科医生的难题。近年来干细胞治疗声带损伤虽取得了一定的进展，但取材及组织来源问题一直是研究的瓶颈。喉黏膜因其范围广，取材相对方便，其组织来源与声带组织结构最为接近，若将其用于喉部组织的缺损修复，将会为声带损伤的患者带来新的希望。.本实验成功地从喉部黏膜中分离培养出了间充质干细胞，并进行了鉴定。结果表明hLM-MSC不仅具有形成不同形态克隆的能力，增殖能力较强而且具有多向诱导分化潜能，是喉部组织工程理想的种子细胞。在此实验基础上，我们进一步对会厌与声带两个不同部位的喉粘膜间充质干细胞进行了生物学特性的比较，发现其生物学特性没有显著的差异。在培养的喉粘膜干细胞中加入炎症因子后通过MTT试验我们发现hLM-MSC的生长增殖能力比对照组有着明显的减慢，细胞凋亡明显增加。通过对炎症诱导的hLM-MSC进行实时定量PCR测定我们发现炎症可以下调与胶原表达相关的基因。. 我们进一步分离培养得到犬喉粘膜间充质干细胞，并将其用于犬声带急性损伤的修复实验。发现喉黏膜间充质干细胞植入受损的声带组织后，其充血水肿较对照组减轻，萎缩程度小，瘢痕形成少。组织切片示喉黏膜间充质干细胞可通过调节细胞外基质成分的合成，改变微环境修复声带损伤。DiI荧光标记干细胞，荧光显微镜下见植入的喉黏膜间充质干细胞主要分布于声带固有层中，术后2 w、4 w及8 w均可观察到植入的LM-MSCs在声带内存活，但随着时间的推移，其存活数量逐渐减少。荧光显微镜下植入的喉黏膜间充质干细胞在受损声带固有层内转化为成纤维细胞及肌成纤维细胞，提示LM-MSCs可通过直接转化为固有层自身细胞参与声带的损伤修复。.此外，我们制备了直径约200-450μm的脱细胞真皮基质微粒(MADM)，将兔脂肪来源干细胞(rASCs)与脱细胞真皮基质微粒复合培养后注入急性损伤的兔声带，观察其对损伤声带的修复重建效果。研究发现 rASCs能粘附MADM表面生长，而且MADM能明显促进细胞增殖，形成 rASCs-MADM 复合体，可行声带内注射。声带注入rASCs-MADM复合体，不仅对声带有填充增容作用，而且减少声带损伤后其固有层的胶原沉积，在一定程度上预防声带萎缩、瘢痕形成。.本课题发表论文12篇，其中国内源期刊论文9篇、SCI论文3 篇，培养硕士研究生3名。