溶瘤腺病毒介导的肿瘤免疫微环境重塑对CAR-T细胞疗效的促进作用及其机制研究

Chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) therapy has made great progress in hematological malignancies, but not satisfied with solid tumors. The most important factor is that CAR-T cells could not break down the barrier of inhibitory tumor microenvironment. So it is the key to breaking the immunosuppressive tumor microenvironment for solid tumors with CAR-T cells. Oncolytic adenovirus mediated tumor immune microenvironment remodeling can reverse the immune suppression status of the tumor microenvironment, enhance tumor immunogenicity and promote the infiltration of inflammatory cells, creating favorable conditions for CAR-T cells. This project plans to construct Her2-CAR overexpression lentivirus and prepare the Her2 specific CAR-T cells. We aim to simulate the tumor microenvironment in the natural state with Her2 positive solid tumor models, verify the promoting efficacy of oncolytic adenovirus mediated tumor immune microenvironment remodeling role for CAR-T cells and explore the immunological mechanisms. It is promising to provide a novel therapeutic strategy and theoretical support in treating solid tumors with CAR-T cells and create a corresponding experimental system through the project.

CAR-T疗法在血液系统肿瘤治疗中取得了可喜的成绩，然而对晚期实体瘤疗效却不尽人意。最主要因素是CAR-T细胞不能突破肿瘤抑制性免疫微环境的屏障。因此，打破肿瘤微环境的免疫抑制成为实体瘤CAR-T疗法的关键所在。溶瘤腺病毒介导的肿瘤免疫微环境重塑可逆转肿瘤微环境的免疫抑制状态，增强肿瘤免疫原性，促进炎性细胞的浸润，对CAR-T细胞发挥效应创造有利条件。本课题拟通过Her2阳性实体瘤的模型，通过构建过表达Her2-CAR的慢病毒载体，建立靶向Her2的CAR-T细胞，利用Her2转基因小鼠模拟自然状态下的肿瘤免疫微环境，验证溶瘤腺病毒介导的肿瘤免疫微环境重塑对CAR-T细胞疗效的促进作用，并探究相关的免疫学机制。通过本课题研究，有望为CAR-T细胞治疗实体瘤提供一种新的治疗策略，并建立相应的实验体系和提供理论支持。

肿瘤微环境的抑制性一直是阻碍免疫疗法治疗实体肿瘤取得良好疗效的重要因素。逆转肿瘤微环境的抑制状态，打破肿瘤微环境中的免疫平衡，促使“冷肿瘤”变成“热肿瘤”，已经成为了肿瘤免疫治疗研究的热点。本课题旨在通过溶瘤病毒逆转肿瘤微环境的免疫抑制状态，促进炎性细胞的浸润，为靶向Her2的特异性CAR-T细胞发挥效应创造有利条件，从而为肿瘤的免疫治疗提供一个新的联合治疗策略。.我们构建了过表达靶向Her2特异性CAR的慢病毒载体，制备了相应的慢病毒，通过体外慢病毒转染T淋巴细胞，成功制备了靶向Her2的特异性CAR-T细胞。我们还构建和筛选了稳定表达Her2的小鼠肿瘤细胞系B16-F10/Her2，为后续体外和体内的抗肿瘤效应验证奠定了基础。体外实验结果显示，所制备的CAR-T细胞与Her2+ SKBR-3和B16-F10/Her2细胞共培养后，ELISA检测到上清中有高水平的IL-2和IFN-γ分泌，LDH assay法显示CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤率达80%以上，说明我们制备的CAR-T细胞能够识别Her2+的肿瘤细胞并对其发挥杀伤效应。我们将B16-F10/Her2接种到Her2转基因小鼠体内成功构建了B16-F10/Her2小鼠荷瘤模型，流式检测结果显示90%以上的肿瘤细胞稳定表达Her2。经过溶瘤病毒处理后的荷瘤小鼠，发现其肿瘤中有更多的CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润，并且分泌IFN-γ的细胞显著增多，说明溶瘤病毒改变了小鼠体内的肿瘤免疫微环境，更利于其他免疫疗法发挥肿瘤杀伤效应。最后，我们将溶瘤病毒与CAR-T细胞联合应用于B16-F10/Her2荷瘤小鼠，发现该联合治疗方案相比于单独应用其中一种疗法，能够更显著地抑制肿瘤生长，延长小鼠生存期，显示出了两者的抗肿瘤协同作用。