AhR/SIRT1对CD4+T细胞DNMT1催化活性的调控及其在系统性红斑狼疮发病中的作用

The downregulation of DNMT1 activity in CD4+T cell contributes to DNA hypomethylation and plays a critical role in the development of SLE. Acetylation/deacetylation has been reported to be involved in the DNMT1 activity regulation. We previously demonstrated that the expression of histone deacetylase SIRT1 was decreased in lupus CD4+T cells. To investigate the function of SIRT1 on DNMT1 activity, we plan to perform RNAi and plasmid transfection to knockdown and overexpress the SIRT1 expression in CD4+T cells. Then DNMT1 activity, acetylation level and acetylated lysine site will be examined. Results from our previous study showed that SIRT1 promoter region contains AhR binding site. To investigate the mechanism of SIRT1 downregulation in lupus CD4+T cells we plan to knockdown AhR expression in CD4+T cells using RNAi. Then the cells will be treated with the specific AhR agonist VAF347, and confocal laser scanning microscopic and ChIP analysis will be performed to confirm the role of AhR in the regulation of SIRT1 expression. This study may provide a new link among AhR, SIRT1 and DNMT1, and elucidate the pathogenesis of SLE.

CD4+T细胞中DNA甲基化酶1（DNMT1）催化活性下调导致DNA低甲基化并参与SLE发病。DNMT1的催化活性可能受乙酰化/去乙酰化修饰的调控。课题组前期研究发现，SLE患者CD4+T细胞中去乙酰化酶SIRT1表达降低，但其功能和下调的机制尚不清楚。本项目拟应用基因转染和RNA干扰技术正、负向调节CD4+T细胞中SIRT1基因表达，通过免疫共沉淀、串联质谱分析等技术检测DNMT1乙酰化水平及位点，分析SIRT1对DNMT1催化活性的影响及机制。拟应用RNA干扰基因沉默CD4+T细胞中芳香烃受体（AhR）基因表达，通过激光共聚焦显微镜及染色质免疫共沉淀等技术研究AhR对SIRT1基因表达的调控作用，分析SLE中SIRT1表达下调的机制。本项目旨在阐明SLE中DNMT1催化活性下调的分子机制，为SLE的干预和治疗提供新的靶点。

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种严重危害人类健康的自身免疫性疾病，其确切的发病机制尚不明确。目前认为，CD4+T细胞DNA低甲基化是SLE发生发展过程中的一个重要环节。本课题组之前的研究表明DNA甲基转移酶1（DNMT1）催化活性的下调在CD4+T细胞DNA低甲基化及SLE的发生发展中起重要作用，并且UVB能够抑制SLE患者CD4+T细胞DNMT1活性。文献报道，去乙酰化酶SIRT1参与多种自身免疫性疾病的发生，且能调控DNMT1催化活性；芳香烃受体（AhR）可能参与UVB诱发SLE。阐明SLE中CD4+T细胞DNMT1催化活性下调的作用机制是本项目的核心内容。本项目收集22名活动期SLE患者及30名正常对照者外周血，分选CD4+T细胞，采用UVB、AhR激动剂VAF347、SIRT1激动剂SRT1720等进行干预培养。采用实时定量qRT-PCR检测mRNA表达水平，Western Blotting检测蛋白表达水平，siRNA基因沉默、荧光试剂盒检测DNMT1催化活性，染色质免疫共沉淀等方法进行研究。本项目的研究表明（1）SIRT1表达水平调控CD4+T细胞DNMT1催化活性，SIRT1表达下降明显抑制DNMT1活性；（2）UVB通过下调SLE患者CD4+T细胞中SIRT1表达进而抑制DNMT1催化活性。SIRT1激动剂干预能够逆转UVB对SLE患者CD4+T细胞中DNMT1活性的抑制作用；（3）AhR激动剂显著抑制正常人CD4+T细胞SIRT1表达。染色质免疫共沉淀研究表明SIRT1启动子上游1.6 kb处出现16倍的ChIP信号。这些实验数据表明SIRT1启动子上游存在AhR的功能性结合位点，并对SIRT1的表达调控起负性调控作用；（4）采用siRNA沉默SLE患者CD4+T细胞AhR表达后，UVB对SIRT1表达的下调作用及对DNMT1活性的抑制作用消失，表明AhR在UVB对SLE患者CD4+T细胞SIRT1/DNMT1轴的抑制作用中发挥重要作用。本项目进一步阐明了SLE的发生机制，明确SLE中DNMT1催化活性下调的分子机制；首次发现AhR/SIRT1/DNMT1这一新的调控通路，为SLE的干预和治疗提供新的靶点。研究成果在Journal of dermatological science等期刊发表。