万古霉素耐药肠球菌依赖于错配修复途径的点突变机制研究

万古霉素耐药肠球菌（VRE）在全球范围尤其在我国的快速增加，给临床治疗带来了极大困难。VRE感染新的主要治疗药物利奈唑胺在国内外快速出现耐药株，部分地区已出现暴发流行，其耐药机制与肠球菌23S rRNA的点突变密切相关。但其点突变耐药株的突变机制及点突变耐药株的耐药性、适应性和毒力三者之间关系尚未阐明。本项目拟采用遗传分析系统，耐药性、毒力和适应性代价测定，基因敲除,蛋白纯化和生化分析等方法，对万古霉素耐药粪肠球菌和屎肠球菌之间的突变热点进行比较，同时结合不同点突变DNA供体转化整合效率和MutS结合不同点突变DNA的能力，研究VRE中不同点突变的出现比例，将有助于我们理解抗生素抗性发生、发展的规律，揭示其进化为多重耐药菌的潜在可能，为深入研究肠球菌突变的分子机制提供良好的基础。明确耐药性的获得对菌株的适应性和毒力的影响，为耐药控制提供理论依据。

万古霉素耐药肠球菌（VRE）在全球范围尤其在我国的快速增加，给临床治疗带来了极大困难。VRE感染新的主要治疗药物利奈唑胺在国内外快速出现耐药株，部分地区已出现暴发流行，其耐药机制与肠球菌23S rRNA的点突变密切相关。本项目采用遗传分析系统，基因敲除,等方法，对粪肠球菌和屎肠球菌之间的突变热点进行比较，研究VRE中不同点突变的出现比例。我们测定肠球菌野生株突变率和突变谱，测定利福平抗性株的MIC 值。利福平耐药与rpoB基因的cluster I突变相关。同样的突变，粪肠球菌具有比屎肠球菌更高的RIF MIC值。屎肠球菌的突变频率和突变率比粪肠球菌低6.8倍。两者的突变谱也有比较大的差异。同时采用蛋白组学对屎肠球菌的rpoB突变株进行研究,发现rpoB突变株的nitroreductase高表达。而这解释了为什么突变株的呋喃妥因的敏感性上升。同时构建肠球菌MutS突变株，并测定肠球菌突变株的突变率。MutS突变株XH205在FOS的突变频率上升了30倍，而在RIF的突变频率上升了50倍。由于在构建MutSL双突变株碰到了困难，我们构建ADP1的mutS mutL双突变株，测定其突变率和突变谱。发现mutL, mutS和mutS mutL的突变频率分别上升了10，32和78倍。同时也构建了耐辐射球菌的nth三突变株，测定其突变率和突变谱。突变率和突变频率测定发现，只有三突变的突变率有比较明显的上升。而突变谱可看出三突变的突变热点也有所改变，更多的发生在GC上。而三突变的突变类型90%为transition。这些数据显示粪肠球菌有更高的潜在能力发展利奈唑胺耐药，需要我们针对性增加对粪肠球菌的临床检验的重视。