BRAFV599Ins插入突变在难治性甲状腺癌中的作用机制研究

BRAF mutation is prevalent in papillary and anaplastic thyroid cancer, and is associated with tumor progression and metastasis. V600E mutation is the representative type of mutation in BRAF gene and is widely studied. V599Ins mutation is a newly reported mutation type in BRAF gene and its function in thyroid cancer remains unknown. We detected this mutation in metastatic thyroid tumors and verified it to be a mutation with "gain of function" in HEK 293 cell line. It could not only activates the MAPK signal transduction but also accelerate the cell growth. What's more, the clinical follow-up data found patient with V599Ins mutation showing characteristics of refractory thyroid cancer. This patient suffered an earlier recurrence and metastasis and was resistant to the radioiodine therapy. In this study, we plan to stably transfect the BRAF vector to human thyroid cancer cell line to further study the function of V599Ins mutation. Then we would like to demonstrate some possible reasons why the patients with V599Ins mutation recurred early as well as resisted to iodide therapy. Finally, we want to test whether the BRAF inhibitor can work or not to the V599Ins mutation. This study will not only further our understanding on the important role of BRAF gene in thyroid cancer, but also provide new evidence on the way to treat the refractory thyroid cancer.

BRAF基因突变在甲状腺乳头状癌和未分化癌频发，且与肿瘤的进展和转移密切相关。V600E是BRAF的经典突变类型，研究非常深入并正尝试运用于临床。V599Ins插入突变是新近发现的突变类型，其在甲状腺癌发生发展中的作用机制尚不清楚。我们前期在转移性甲状腺癌的多个病灶中检测到这一突变（Human Pathology 2010），293细胞初步证实其可能为功能获得型突变，可使下游MAPK信号通路持续激活，细胞增殖明显加快。临床随访提示该突变患者复发转移早且对临床碘治疗抵抗，表现出难治性甲状腺癌的临床特征。本研究拟通过建立稳定表达BRAF的人甲状腺癌细胞系和裸鼠移植瘤模型，深入研究V599Ins插入突变可能获得的生物学功能，比较与经典V600E突变之间的差异；进一步探索该突变与甲状腺癌转移发生早，碘治疗耐药的难治性特征之间的内在联系，为临床认识和治疗难治性甲状腺癌提供新的科学依据。

甲状腺癌是目前发病增长最快的恶性肿瘤，乳头状癌是其最常见的病理类型且预后良好，但有约5%的甲状腺乳头状癌复发及远处转移，最终会对临床常规的同位素及TSH抑制治疗失效而成为甲状腺癌患者的主要死因。甲状腺未分化癌虽少见，但其极具侵袭的恶性生物学行为和临床缺乏有效的治疗手段而成为甲状腺癌患者的又一重要死因。BRAF基因突变是近年来甲状腺癌研究领域最突出的进展之一。研究报道该突变只发生在甲状腺乳头状癌和未分化癌，且在复发或转移性甲状腺癌中的发生率更高。V600E是BRAF基因的经典突变类型，研究深入并正尝试运用于临床。课题组前期在转移性甲状腺癌的多个病灶中检测到BRAFV599Ins突变，临床随访提示携带该突变患者复发转移早且对临床碘治疗抵抗，表现出难治性甲状腺癌的临床特征。本研究通过慢病毒载体构建人稳定表达BRAFV599Ins、BRAFV600E突变的甲状腺癌细胞，验证了两者的功能类似：S期细胞比例增多，增殖明显加快；侵袭及克隆形成能力增强。下游的MAPK信号通路持续激活可能是细胞生物学行为改变的原因。利用大样本临床数据库对BRAF基因突变的发生规律及临床价值进行研究，结果显示BRAFV599Ins突变在难治性甲状腺癌患者中非常少见（1/53），而BRAFV600E突变较为常见，且与甲状腺癌的双侧性现象存在统计学关联，长时间的随访更首次证实了与BRAF突变密切相关的双侧甲状腺癌预后特征异于普通的甲状腺癌，表现出了高淋巴结转移及高复发率，这一结果为临床处置双侧性甲状腺癌提供了重要的依据。本研究最后在体外和体内同时证实BRAF突变甲状腺癌细胞对RAF靶向抑制剂Vemurafenib存在天然耐药现象：甲状腺癌细胞对Vemurafenib的IC50值均大于1000uM,未分化甲状腺癌的IC50值更大，且该药仅能抑制甲状腺癌荷瘤模型的肿瘤生长，而不能使肿瘤缩小；在此基础上，本研究最后初步证实，甲状腺癌细胞株饥饿应激下的细胞自噬水平明显上调，且该上调能力存在差异，未分化癌细胞株的自噬上调比例高于乳头状癌细胞株，同时细胞自噬可被Vemurafenib诱导激活，这是否提示细胞自噬在甲状腺癌对Vemurafenib天然耐药中发挥重要作用还有待深入研究。本研究进展顺利，最终取得一定成果（发表SCI论文2篇，其中一篇IF>5；参加国际会议并发表研究成果2次，其中一次为口头报告并获得学术奖项。