杆状病毒类精蛋白P6.9磷酸化调控病毒粒子相变的分子机理研究

Baculovirus has been widely used as virus insecticide and, it is a main eukaryotic expression vector system. It produces two phenotypes of progeny virions, budded virion (BV) and occlusion-derived virion (ODV), which can be converted into each other and play respectively the media role in the processes of system infection and oral infection. But until now the molecular mechanism of transformation is still unknown. P6.9, a protamine-like protein encoded by baculovirus, is the core protein of BV and ODV. We found that P6.9 is present in the form of non-phosphorylation and multistage phosphorylation in BV and ODV. The further study shows the 13 Ser/Thr phosphorylation sites in P6.9 can form a variety of phosphorylation combination patterns by arranging and combining, then the P6.9 with different phosphorylation combination patterns regulate, respectively, the transcription status of virus’ different genes. This implies one of P6.9’s phosphorylation combination is the key to the transformation between BV and ODV. The objective of this project is to construct a phosphorylated combination mutant recombinant virus whose ODV generation is blocked, and taking this virus as the object to investigate the relationship between the phosphorylation of P6.9 and BV, ODV. Using comparative transcriptome analysis, we will obtain the differentially expressed genes between mutant virus and wild type virus, then can screen the key genes that affect phase change, and elucidate the molecular mechanism of phase transformation to provide a new theoretical basis to genetic improvement of baculovirus for biological control of pests.

杆状病毒是应用潜力巨大的病毒杀虫剂，也是主要的真核蛋白表达载体。它能在一个感染周期产生芽生型（BV）和包埋型（ODV）两种病毒粒子，且分别是病毒在细胞间与虫体间的传播形式。BV与ODV可以互相转变（相变），但是其分子机制至今未知。类精蛋白P6.9是杆状病毒编码的核髓蛋白，我们发现它在BV与ODV中分别以非磷酸化和多级磷酸化的形式存在；进一步研究又发现它的13个Ser/Thr磷酸化位点能形成多种磷酸化组合，调控病毒不同基因的转录，暗示了P6.9的某种磷酸化组合是影响病毒粒子相变的关键。本项目拟通过构建ODV形成阻断、BV产量增加的AcMNPV P6.9磷酸化组合突变型病毒，并以此病毒为模型，探究P6.9磷酸化组合与BV、ODV形成的关系；通过比较转录组学的方法得到突变与野生型病毒的差异表达基因，筛选影响相变的关键基因，阐明相变的分子机理，为改造杆状病毒用于植物害虫生物防治提供新的理论依据。

杆状病毒是应用潜力巨大的病毒杀虫剂，也是主要的真核蛋白表达载体。它能在一个感染周期产生芽生型（BV）和包埋型（ODV）两种病毒粒子，且分别是病毒在细胞间与虫体间的传播形式。BV与ODV可以互相转变（相变），但是其分子机制至今未知。申请人以杆状病毒类精蛋白P6.9为研究对象，从表观遗传角度分析病毒中精蛋白的翻译后修饰对病毒基因表达调控的影响，为阐明P6.9的翻译后修饰对病毒粒子相变奠定基础。本项目研究结果如下：（1）质谱分析并鉴定了细胞中P6.9的磷酸化位点组合模式，构建了20组P6.9磷酸化位点突变型重组病毒，发现其中S17,T18,S23,S24位点组合突变型重组病毒感染细胞后只影响了ODV形成，不影响 BV 生成。（2）利用同源建模构建了P6.9的3-D模型，分析P6.9表面静电势，分析发现S17,T18,S23,S24磷酸化后极大改变了P6.9的表面的电荷分布，为阐明该磷酸化组合模式调控杆状病毒基因的表达提供了结构基础。（3）通过比较转录组学的方法得到77个突变与野生型病毒的差异表达基因。（4）发现了调控病毒相变的3类关键基因簇： 相变基因（fp25K、 Ac66）、 actin 组装基因（p78/83、 Ac102）及一系列特定影响昆虫口服感染的 Pif 因子，且这些基因簇均为参与了核衣壳运输或只影响了 ODV 的表达及病毒的口服感染的因子，这表明P6.9通过影响上述3类基因簇的表达调控BV与ODV的转变。综上，本研究为阐明 P6.9 对病毒基因表达调控功能及 BV 与 ODV 的相变提供理论基础，同时为杆状病毒生物杀虫剂的改造提供新的理论依据及重要参考。