杆状病毒pk-1基因调控病毒极晚期转录的分子机制研究

杆状病毒AcMNPV的极晚期基因如多角体基因具有超强表达的能力，这使得其成为最广泛使用的真核表达载体之一。然而病毒极晚期基因超量表达的机制目前还并未阐明。已有研究表明杆状病毒的pk-1基因参与病毒极晚期转录调控，但具体机制并不清楚。本课题拟利用原核表达不同点突变或截短型pk-1基因，并进行激酶活性分析，以揭示PK-1蛋白的结构与激酶活性的关系。通过EMSA分析多角体启动子与PK-1亲和的序列特异性。通过缺失互补实验，分析突变pk-1对缺失pk-1 病毒的极晚期基因表达的拯救与否，确定PK-1蛋白调节杆状病毒极晚期转录的功能域。另外，通过分子相互作用实验，确定与PK-1相互作用的晚期转录相关因子，利用体外激酶催化实验，分析PK-1激酶活性对晚期转录因子的作用和特异性。最后，分析PK-1蛋白对晚期转录因子的磷酸化与调控极晚期基因转录的关系。从而揭示杆状病毒pk-1基因调控极晚期转录的分子机理。

病毒编码的蛋白激酶只存在于大型的DNA病毒中，在疱疹病毒中，其主要与病毒的毒力有关。在杆状病毒中，AcMNPV也编码了一个蛋白激酶——PK-1。PK-1是一个高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，目前它的功能还并不清楚。本项目对PK-1的激酶活性催化域及其在病毒复制、增殖过程中的功能进行了研究。为了研究PK-1在病毒生命循环过程中的作用，分别构建了pk-1缺失、拯救的重组AcMNPV Bacmid。缺失pk-1基因的AcMNPV Bacmid 没有感染症状产生，而pk-1拯救的AcMNPV Bacmid可以互补pk-1的缺失，产生感染性病毒粒子。因此，pk-1为病毒复制必需基因。实时荧光定量PCR（qPCR）结果显示，pk-1基因的缺失不影响病毒DNA的复制。通过构建一系列pk-1截短型拯救的AcMNPV Bacmid并分析了它们拯救能力，结果表明PK-1的蛋白激酶催化域（PKc）对于感染性病毒的产生是至关重要的。原核表达这些截短体并体外分析它们的激酶活性，结果表明那些能够拯救缺失pk-1 AcMNPV 的截短片段都具有激酶的活性，而不能拯救缺失pk-1 AcMNPV 的截短片段都没有检测到激酶活性。因此，PK-1的激酶活性对于病毒的复制至关重要。电镜切片观察显示，pk-1基因的缺失的重组病毒不能产生正常的核衣壳，而产生了大量未包装病毒基因组的长的空管状结构。推测PK-1通过磷酸化与DNA包装相关的蛋白来影响病毒核衣壳的组装。