二硫键异构酶PDI和ERp57调控动脉血栓形成的特异性生理作用与机制研究

Thrombosis is the clot formation inside blood vessel, resulting from the activation of platelets and coagulation system. The mechanisms underlying the initiation of thrombosis are very complex and remain largely unknown. Recently we and others have reported that two members of protein disulfide isomerase (PDI) family, PDI and ERp57, are important in thrombosis, probably via thiol redox control of major haemostatic proteins. Because the global deficiency of PDI or ERp57 in mouse is embryonic lethal, and they have distinct functions and substrate spectrum in other physiological processes, we hypothesize based upon our preliminary studies that PDI and ERp57 play a specific role in thrombosis. This hypothesis is innovative because in the initiation of thrombosis, the physiological role of PDI and ERp57 is unclear. In this proposal, we have generated the tissue-specific gene knockout mouse models lacking PDI or ERp57, we plan to utilize in vivo thrombosis assays, cell biological, biochemical and molecular approaches. Our hypothesis will be tested through the pursuit of the following two specific aims: Aim 1 will determine the specific role of PDI and ERp57 in platelet accumulation and fibrin deposition, and will define the cellular and tissue resources of PDI and ERp57 for the initiation of thrombosis. Aim 2 will dissect the molecular mechanisms by which PDI and ERp57 regulate the functions of platelet receptors and the activities of coagulation factors. These proposed investigations will provide fundamental knowledge of the physiological role of PDI and ERp57 in thrombosis, as well as a novel insight into their coordination mechanisms in regulating platelet functions and coagulation system. The results to be achieved will not only improve in depth our understanding of the molecular and cellular mechanisms of thrombosis, but will also identify new potential therapeutic targets for antithrombotic treatment.

血栓形成是血小板活化和凝血系统激活导致的血液凝固，其启动机制异常复杂。近来国外和我们的研究表明，二硫键异构酶PDI和ERp57通过对功能性蛋白二硫键的氧化还原，既控制血小板活化，又控制凝血系统激活，在血栓形成启动中起独特的关键作用。因为在其它生理功能中PDI和ERp57的作用及底物谱不同,而且二者全身敲除小鼠均在胚胎期死亡，说明二者功能不能互相代偿，基于前期研究，我们推测PDI和ERp57在血栓形成中的作用具有特异性。为检验这一假说，我们在世界上首建了PDI和ERp57组织特异性基因敲除小鼠模型，将通过体内血栓模型和体外研究，判定PDI和ERp57在血小板活化和凝血系统激活中的特异性生理作用和细胞组织来源，并剖析其作用机制。预期结果将为揭示二硫键异构酶对血小板活化和凝血系统激活的双重调控作用，及阐明血栓形成启动的细胞与分子机制带来突破性认识，并推动以二硫键异构酶为靶向的抗血栓药物的研发。

血栓形成是血小板活化和凝血系统激活导致的血液凝固，其启动机制异常复杂。近来国外和我们的研究提示，二硫键异构酶（PDI）家族通过对功能性蛋白二硫键的氧化还原，既控制血小板活化，又控制凝血系统激活，在血栓形成启动中起独特的关键作用。但是，因为PDI家族由20种成员组成，以往依赖于抑制剂的研究无法判定该家族成员在血栓形成中的特异性作用，所以导致哪些成员参与血栓形成及其各自的作用是什么等诸多重要科学问题无法解决。在本项目中，我们建立了组织特异性PDI和ERp57基因敲除小鼠，综合血栓模型，细胞生物学，生物化学，分子生物学及蛋白质谱学等多种体内和体外研究方法，对该家族的主要成员PDI和ERp57在血栓形成中的特异性作用和作用机制进行了研究。研究结果表明：在FeCl3诱导的颈动脉血栓损伤和肠系膜动脉，以及激光诱导的提睾肌动脉损伤等多种血栓模型中， PDI和ERp57缺陷小鼠血小板积聚和纤维蛋白形成均显著性减弱； 在血栓形成早期，PDI及ERp57的主要细胞来源是内皮细胞和血小板； 应用血小板膜受体抑制剂和整合素b3敲除小鼠阻断体内血小板积聚，静脉输入重组PDI和ERp57蛋白直接增强凝血系统活化，说明PDI和ERp57调控凝血系统的作用不依赖于血小板活化；PDI或ERp57缺陷的血小板对多种受体激活剂介导的血小板活化（聚集、颗粒释放、铺展能力，以及整合素IIb3活化）均减弱；二者在血小板表面的主要作用靶点是整合素aIIbb3。 应用的单一活性结构域的重组蛋白和PDI点突变小鼠，鉴定出PDI和ERp57的C端CGHC功能域是二者调控血栓形成的主要活性位点。通过与基因缺陷表型进行比对，明确了PDI和ERp57单克隆抗体对血栓形成具有特异性的抑制性效应。 在凝血酶产生的动态分析中， PDI和ERp57的抑制性抗体具有减少凝血酶产生的作用。这些研究结果说明PDI和ERp57 在血栓形成机制中发挥重要的特异性调控作用，揭示了血小板活化和凝血系统激活的共同机制以及PDI和ERp57在这一机制中的双重效应，为阐明血栓形成启动机制提供了革新性的认识，并推动以二硫键异构酶为靶向的抗血栓药物的研发。