Gemini阳离子表面活性剂反胶束液液萃取分离纯化蛋白质的效能及机理研究

Separation and purification of protein, a key to the preparation of protein, is currently limiting its application. Liquid-liquid reverse micellar extraction can be easily scaled up and operated in continuous mode with reverse micelle used repeatedly, and hence receives much concern. So far conventional ionic surfactants di-2-ethylhexyl sodium sulfosuccinate and cetyl trimethyl ammonium bromide have been almost exclusively used in reverse micellar extraction. Recently, we extracted bovine serum albumin with gemini cationic surfactant octamethylene-1,8-bis(dimethyl dodecyl ammonium bromide) (12-8-12) reverse micelle and found 12-8-12 displayed distinct advantages over monomeric surfactant in the liquid-liquid reverse micellar extraction process: 1) the extraction condition with 12-8-12 reverse micelle was much milder, 2) the extration system with 12-8-12 reverse micelle was not emulsified, and 3) the loading capacity of 12-8-12 reverse micelle was much higher. In this project we will extract different proteins with gemini cationic surfactant reverse micelles from natural products, and study 1) the extraction efficiencies of different proteins, 2) the changes of reverse micellar structure and oil/water interfacial property during extraction, and 3) the effect of extraction process on the structure and activity of protein. We will further propose the extraction mechanism and optimize the gemini surfactant structure and reverse micelle composition according to the property of the target protein. This research should be meaningful for the development of the technique for protein separation and purification.

蛋白质分离纯化技术是蛋白质产品制备的关键技术之一，也是当前蛋白质应用的一个瓶颈。反胶束液液萃取蛋白质技术因具易于放大、可实现连续操作、反胶束相可循环利用等特点而倍受关注。目前用于蛋白质萃取的表面活性剂多限于传统离子型表面活性剂。最近我们以Gemini阳离子表面活性剂二溴化N,N'-二(二甲基十二烷基)-1,8-己二铵反胶束萃取牛血清白蛋白，发现它表现出诸多一直令人期待的优势：萃取条件温和、体系不易乳化、蛋白质装载量大。本项目拟用Gemini阳离子表面活性剂反胶束从复杂基体中提取多种蛋白质，深入系统地研究该类反胶束对蛋白质的萃取效能、萃取过程中反胶束微观结构变化和两相界面行为变化、萃取过程对蛋白质结构和活性的影响，探究萃取机理，根据目标蛋白质性质设计、优化Gemini表面活性剂结构和反胶束组成，实现复杂基体中不同种类蛋白质的高效提取，为蛋白质分离纯化提供切实可行的解决思路与方案。

蛋白质的分离纯化技术是制约蛋白质应用的一个重要瓶颈。反胶束是表面活性剂分子在有机溶剂中自发形成的含有水核结构的一种聚集体。与其它蛋白质分离方法（如盐析法、沉淀法、层析法、电泳法、高效液相色谱法等）相比，反胶束萃取技术将提纯与浓缩集于一起，具有易于放大、可实现连续操作、萃取相（即反胶束相）可循环利用等特点，因而备受关注。目前反胶束提取技术大多采用传统离子型表面活性剂，具有萃取体系易乳化、蛋白质的提取效能和活性均较低等严重问题。本项目以系列新型表面活性剂Gemini阳离子表面活性剂所形成的反胶束对多种蛋白质进行了提取，系统研究了萃取过程中各项参数，如蛋白质的结构、性质与含量、表面活性剂的结构与浓度、反胶束组成、pH、离子强度等对蛋白质的提取效能及作用机制，发现Gemini表面活性剂反胶束对蛋白质的装载量和萃取效能远远高于传统表面活性剂反胶束，且Gemini表面活性剂反胶束萃取体系不易乳化，萃取条件更温和，可在很宽的pH、离子强度、表面活性剂浓度的条件下进行蛋白质的高效提取，蛋白质的活性回收率和纯化倍数均令人满意。Gemini表面活性剂连接基团的长度和柔韧性及疏水链的长度可控制此类表面活性剂与蛋白质间的静电作用和疏水作用强度，影响反胶束水核和油水两相界面张力，从而决定了蛋白质在油水两相间的迁移能力。当目标蛋白质水溶性能好、疏水性能弱时，连接基团较长或疏水链较短的Gemini表面活性剂反胶束对目标蛋白质的增溶量和萃取效能较好。当目标蛋白质水溶性能差、疏水性能强时，连接基团较短或疏水链较长的Gemini表面活性剂反胶束对目标蛋白质的增溶量和萃取效能较好。当表面活性剂的极性头基含有糖基单元时，具有葡萄糖基单元的表面活性剂对蛋白质在油水两相迁移的促进作用显著强于具有乳糖基单元的表面活性剂。本项目通过使用Gemini阳离子表面活性剂，实现了复杂机体中活性蛋白质的高效提取，表明Gemini表面活性剂在蛋白质提取中具有令人瞩目的优势，为解决反胶束液液萃取蛋白质技术所面临的问题提出了切实、可行的解决思路与方案。