黄斑蓝子鱼对刺激隐核虫的天然抗性机制研究

刺激隐核虫已经成为我国海水养殖业危害最大的寄生虫，它能够感染几乎所有的海水硬骨鱼类，但黄斑蓝子鱼对其具有天然抗性，几乎不被感染。我们发现黄斑蓝子鱼血清中含有对刺激隐核虫具有强烈杀灭作用的抗虫因子，但尚不清楚这些杀虫因子的性质及作用机制。本研究将深入分析黄斑蓝子鱼血清和黏液中杀虫因子的种类、性质、来源、组织分布、表达水平；分离鉴定对刺激隐核虫具有天然杀灭作用的活性因子，分析其分子结构，建立其纯化方法，克隆鉴定抗虫基因，进行基因工程表达，测定重组蛋白的抗虫活性；通过揭示活性因子杀虫的作用靶点及作用途径，阐明活性因子的杀虫机理。通过上述研究，确定黄斑蓝子鱼抗刺激隐核虫的物质基础，阐明黄斑蓝子鱼对刺激隐核虫的天然抗性机制。在此基础上，进一步开展抗虫活性因子的初步应用研究，以期为刺激隐核虫的防治开辟新途径。本项目的结果对研究鱼类的先天性免疫和寄生虫病防控都有重要的意义。

刺激隐核虫已经成为我国海水养殖业危害最大的寄生虫，它能够感染几乎所有的海水硬骨鱼类，但黄斑蓝子鱼对其具有天然抗性，几乎不被感染。我们发现黄斑蓝子鱼血清中含有对刺激隐核虫具有强烈杀灭作用的抗虫因子，但尚不清楚这些杀虫因子的性质及作用机制。. 在本研究中，我们从其血清中分离到了一种抗微生物蛋白（APP），确定APP蛋白属于L-氨基酸氧 化酶（LAAO）家族一员，进而获得了该APP蛋白的的cDNA序列全长。然后实现了 SR-LAAO 在 大肠杆菌的重组表达，通过MTT分析、 光学显微镜观察和扫描显微镜观察结果表明，SR-LAAO重组蛋白对刺激隐核虫幼虫具有显著的细胞毒性，重组蛋白整个杀虫过程与黄斑蓝子鱼血清中分离到的天然SR-LAAO体外作用于刺激隐核虫幼虫的过程相似。此外，利用SR-LAAO重组蛋白纯品作为抗原，免疫小鼠，制备了小鼠SR-LAAO重组蛋白的多克隆抗血清，该小鼠多克隆抗血清可用于SR-LAAO重组蛋白的识别和检测。随后我们实现了SR-LAAO在真核表达系统—毕赤酵母表达系统的重组表达，诱导表达产物对测试菌，均具有抑菌活性。扫描电镜观察结果发现，细菌表面变得粗糙，有明显的颗粒状附着物，细胞壁有内陷，细胞膜有发生破裂。在获得大肠杆菌重组表达的 SR-LAAO 重组蛋白纯品的基础上，制备了SR-LAAO 重组蛋白的单克隆抗体。将3-HSR2 细胞株纯化后的单克 隆抗体稀释 1000倍，可作为特异抗体检测大肠杆菌诱导表达的 SR-LAAO 重组蛋白，而将抗体稀释 500倍后，可作为特异抗体对黄斑蓝子鱼血清 SR-LAAO 进行识别，该抗体可用于免疫亲和层析柱的研制，以及 SR-LAAO 免疫机制的进一步研究。. 本研究阐明了SR-LAAO的性质、来源、组织分布、表达水平、杀虫的作用位点和作用途径等问题，从分子水平解析这种活性因子抗刺激隐核虫的作用机理，研究成果具有重要的理论价值和深远的现实意义，一方面，从分子水平阐明这种活性物质的抗虫机制，揭示了黄斑篮子鱼抗刺激隐核虫感染的根本原因，为进一步研究鱼类抵御寄生虫感染的先天性免疫机制提供了理论基础。另一方面，抗虫活性因子的初步应用研究为刺激隐核虫的防治开辟了一条新途径，在目前急需切实有效防控措施的情况下，无疑具有广阔的应用前景。