黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶对无乳链球菌的抑杀作用机制研究

In our previous study, we isolated a significant antimicrobial L-amino acid oxidase (named SR-LAAO) from the serum of Siganus oramin. The results of antimicrobial spectrum showed that SR-LAAO had a strong inhibitory effect on important pathogens, Streptococcus agalactiae. But the antibacterial mechanism of SR-LAAO to S. agalactiae was unknown. In this project, the dynamic process of SR-LAAO killing S. agalactiae was observed by electron microscopy imaging. Through reactive oxygen species (ROS) measured, monoclonal antibody binding inhibition and protein FITC labeled imaging method, to reveal whether SR-LAAO could selective bind the surface of S. agalactiae and partially produce high concentrations of ROS, or directly produce high levels ROS in the environment to kill bacteria; By comparison transcriptome analyses, to analyze the different antimicrobial molecular mechanisms between SR-LAAO and ROS; Using N-glucosidase hydrolysis experiments and point mutagenesis techniques, to elucidate whether glycosylation had played an important role in the anti- S. agalactiae activity of SR-LAAO. All in all, this project will further reveal the antimicrobial mechanism of SR-LAAO, and provide theoretical basis for developing new potential antibacterial agent.

在前期的研究中，我们从黄斑蓝子鱼血清中分离到了具有显著抗微生物活性蛋白—黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶（SR-LAAO）。其抗菌谱表明，SR-LAAO对重要病原—无乳链球菌具有强烈的抑杀作用。关于SR-LAAO对无乳链球菌抑杀作用机制未知。本项目通过电子显微成像，揭开SR-LAAO对无乳链球菌细胞毒性的动态过程；采用活性氧（ROS）定量、ROS水解剂抑制、单克隆抗体拮抗、FITC标记成像，解答SR-LAAO是通过与无乳链球菌细胞表面选择性结合，局部产生高浓度ROS抑杀细菌，还是直接通过产生高浓度的ROS抑杀细菌；利用差异转录表达谱，比较分析SR-LAAO与ROS分别抑杀无乳链球菌的分子机制差异；通过N-糖酰胺酶水解实验，以及点突变技术，明确糖基化在SR-LAAO抑杀无乳链球菌过程中发挥的作用。本项目的开展有助于进一步揭开SR-LAAO的抗菌机制，为开发新型绿色抗菌药物提供理论基础。

在前期的研究中，我们从黄斑蓝子鱼血清中分离到了具有显著抗微生物活性蛋白—黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶（SR-LAAO），其抗菌谱表明，SR-LAAO对重要病原—无乳链球菌具有强烈的抑杀作用，但关于SR-LAAO对无乳链球菌抑杀作用机制未知。本项目根据昆虫细胞密码子的偏嗜性对黄斑蓝子鱼SR-LAAO的基因序列进行优化合成，构建和优化了SR-LAAO体外重组表达体系，获得了SR-LAAO重组蛋白，开展了重组表达产物的抑菌效果及酶学特性进行评价，观察了重组SR-LAAO对无乳链球菌细胞毒性的动态过程，分析ROS在SR-LAAO对无乳链球菌抗菌活性中发挥的作用，比较了SR-LAAO和H2O2 抑杀S. agalactiae代谢机制的差异。实验结果表明，按照昆虫细胞密码子的偏嗜性优化后的SR-LAAO可在昆虫Sf9细胞中显著表达，SR-LAAO重组蛋白对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有抑菌活性，其中分别对无乳链球菌和副溶血弧菌的抑菌效果最强，SR-LAAO对无乳链球菌的抑菌作用依赖于ROS的产生；但细胞毒性的动态过程观察结果表明H2O2和SR-LAAO对无乳链球菌的抑杀机过程存在显著不同；非靶向差异代谢组学分析结果显示研究，H2O2处理组与SR-LAAO处理组相比，具有差异显著差异的阳离子代谢产物有129个，阴离子代谢物有104个，分别富集到20个代谢通路，在L-氨基酸差异代谢物的分析中，H2O2处理组与LAAO处理组相比，L-麦角硫氨酸（L-Ergothioneine）极显著上调表达，结果暗示SR-LAAO的处理可能显著分解了L-Ergothioneine或者抑制了无乳链球菌该氨基酸的合成，SR-LAAO对无乳链球的抑菌活性可能受到L-麦角硫氨酸的间接调控。本项目结果为进一步开发新型鱼类抗微生物制剂提供了基础，同时为鱼类LAAO的广泛开发应用提供了最直接的参考。