水稻硫氧还蛋白对OsPHO2的分子调控及其在磷代谢中的生理功能研究

PHO2, encoding an ubiquitin E2 conjugase (UBC24), is an important negative regulator of the PHR1-miR399/IPS1-PHO2 signal pathway in plant phosphate homeostasis. Our unpublished data showed that there is a significant function difference between rice and arabidopsis PHO2. Yeast two hybridization screening of the rice phosphate-deficient cDNA library identified two thioredoxins, OsTrxA and OsTrxB, interacting with OsPHO2. The interaction is a rice-specific. In other words, it does not existing in Arabidopsis. In this study, we will use site-mutagenesis to construct the mutant versions of OsPHO2s, in which the putative interaction sites, cysteins, in the OsPHO2 amino acid sequence were mutated into alanine or serine to abolish the reduction mediated by the thioredoxins OsTrxA and OsTrxB. Transgenic rice plants with enhanced or reduced expression levels of TrxA and B will be created through overexpression, RNA interference, and CRISPR technology. The physiological performance and phosphate homeostasis of these transgenic plants will be evaluated to unravel the mechanism and function that TrxA/B regulate the oxidative/reductive status of OsPHO2. In addition, the wildtype and mutant forms of OsPHO2 will be expressed into the ospho2 mutant rice to see the roles of the oxidative/reductive status of OsPHO2 on phosphate homeostasis. The study will elucidate a new molecular mechanism to complete the rice phosphate signaling network. The new knowledge is potentially useful for engineering of rice plants with improved phosphorus use efficiency.

PHO2编码E2泛素结合酶UBC24，是PHR1-miR399/IPS1-PHO2磷信号通路中调控磷稳态的重要负调控因子。我们近期研究发现拟南芥与水稻 PHO2蛋白在功能上存在重要的差异。酵母双杂交筛选缺磷水稻cDNA文库，获得了与OsPHO2互作的硫氧还蛋白TrxA和TrxB，并明确这种互作在拟南芥中不存在。本研究拟利用定点突变结合酵母双杂等蛋白互作技术，明确OsPHO2蛋白中与硫氧还蛋白互作的关键半胱氨基酸位点；分析互作蛋白TrxA/B的超表达和抑制表达材料，阐明TrxA/B参与调控OsPHO2的氧化还原状态的机制及其功能；培育在水稻pho2中表达野生型OsPHO2和互作位点突变OsPHO2-M的转基因材料，并比较其生理特性和植株磷稳态变化，阐明OsPHO2蛋白氧化态和还原态的调控机制及其功能。本研究将为完善水稻磷信号网络、指导磷高效分子育种提供重要依据。

PHO2编码E2泛素结合酶UBC24，是PHR1-miR399/IPS1-PHO2磷信号通路中调控磷稳态的重要负调控因子。为了深入了解水稻PHO2蛋白的功能及作用机制，本研究首先通过酵母双杂Y2H筛选并验证了硫氧还蛋白OsTrxh1和OsTrxh4可与OsPHO2互作；分离泛素Y2H和BiFC实验表明OsPHO2在内质网和高尔基体与OsPHO1;2和OsPHF1互作，并在烟草叶片和水稻苗中降解OsPHF1，因而解释了PHO2突变体磷超积累的分子机制。分析水稻pho2的回复株系发现，表达内源基因组OsPHO2C445S（持续还原状态）比不突变的OsPHO2 能更好回复突变体的表型。另外，OsTrxh1的抑制表达可引起叶片磷浓度略高于野生型。本研究揭示了水稻磷稳态调控与氧化还原状态之间存在关联。硫氧还蛋白可以调控OsPHO2蛋白的氧化还原状态，从而调节其在调控磷稳态过程中的活性。上述成果发表在Plant Physiology (Ying et al., 2016) 上。.研究过程中，我们还发现了OsPHO2蛋白与开花的关键调控因子GIGANTEA（GI）互作。pho2和gi突变体表型分析，发现这两个突变体植株在延迟开花和叶片中磷超积累等方面具有相似的表型。突变体叶片中开花基因OsHd3a的表达在植株生长过程中持续地被显著抑制，而其上游的负调控因子OsHd1的表达则高于野生型。另一方面，gi突变体在地上部分超积累无机磷，且无机磷从老叶活化转移至新叶的能力受阻，与pho2类似。基因芯片的数据分析结果表明，pho2和gi突变体具有相似的基因共表达模式，超过55%的在gi中表达上调/下降的基因，同时在pho2中表达会发生变化。综上所述，OsGI与OsPHO2的相互作用说明植物调控开花时间和维持磷稳态的分子机制之间存在信号交流。上述成果发表在Plant Cell & Envir. (Li et al., 40:1487-1499)上。研究中，我们还发现OsGI在水份胁迫的抗性中具有功能。OsGI突变后提高了水稻对PEG介导的水份胁迫的抗性、脯氨酸、糖含量及气孔的开度。.项目共发表具有标注的SCI论文10篇，总影响因子超过50。其中论文1-7为本项目的直接研究成果，论文8-10为相关研究成果。