H5N1禽流感病毒NS1蛋白与人NOLC1蛋白的相互作用在CK2相关信号通路及感染机制中的作用研究

Nonstructural protein 1 (NS1) of the highly pathogenic avian influenza virus H5N1 is closely related to the virulence. We have detected and verified the interaction between NS1 and nucleolar and coiled-body phosphoprotein 1 (NOLC1) in our preliminary work. NOLC1 is a highly phosphorylated protein that participates in some signaling pathways related to cell growth and differentiation, as well as apoptosis. According to our preliminary result and the literature, we can infer that the interaction between NS1 and NOLC1 may affect the subcellular localization of NS1, a number of host cell signal pathways and viral replication. This research proposal will focus on the following three aspects: (1) To elucidate the relationship between NS1-NOLC1 interaction and the nucleolus localization of NS1; (2) To determine the effect of NS1-NOLC1 interaction on CK2-related signaling pathways in the host cell. This proposal therefore aims to address the biological function conferred by the interaction between NS1 and NOLC1, and to investigate the underlying mechanism of infection by avian influenza virus, so that new ways to provide protection against infection caused by influenza virus can be contemplated.

H5N1高致病性禽流感病毒的NS1蛋白(non-structural protein 1)与致病性密切相关。本课题组首次发现人核仁磷酸化蛋白(NOLC1)与NS1存在相互作用。NOLC1是一个高度磷酸化的蛋白，参与炎症发生、细胞生长和细胞凋亡等相关信号通路。根据前期研究和文献推断NS1与NOLC1相互作用会对NS1蛋白的亚细胞定位、宿主细胞相关信号通路、以及禽流感病毒的复制产生重要影响。本项目进行如下研究：（1）NS1-NOLC1相互作用与NS1核仁定位的关系的研究；（2）NS1-NOLC1相互作用对宿主细胞CK2相关信号通路产生的影响。本研究将探索NS1-NOLC1相互作用的生物学意义，揭示禽流感病毒感染的机制，为药物靶点研究提供了可能，为流感病毒防治提供新的思路。

该项目旨在探索禽流感病毒NS1与人NOLC1相互作用的生物学功能，进一步解析禽流感病毒致病机理，为 NS1-NOLC1相互作用及作为药物靶点的研究提供理论基础。在国家自然基金的资助下，该项目进展顺利，两年内发表8篇论文，圆满完成预期目标。项目组研究发现：NS1与NOLC1相互作用，且共定位于细胞核。NS1的外源性表达促进NOLC1的mRNA表达而抑制NOLC1的蛋白表达，同时提高了细胞中NOLC1蛋白的磷酸化水平。NOLC1作为一种高度磷酸化蛋白，主要依赖于CK2广泛磷酸化发挥其重要功能，而NS1蛋白的表达抑制了细胞中CK2的表达水平。进一步检测COX2，AMPK，MMP7，Beta-catenin，CDK4，Bcl2，c-Myc，cyclinD，APC，和NF-kB共10个与细胞周期、细胞生长、细胞凋亡相关的细胞因子的mRNA水平，我们发现NS1-NOLC1相互作用对cyclinD，Bcl2和NF-kB有促进作用，对CDK4有抑制作用，其中NF-kB是CK2相关信号通路的下游信号分子之一。NS1的表达显著增加了细胞中流感病毒NP蛋白的cRNA和mRNA，且过表达NS1的细胞在H3N2流感病毒的感染下产生了更显著的细胞病变，说明NS1过表达对H3N2流感病毒复制具有一定的促进作用。检测转染48小时后的细胞凋亡水平，我们发现：同时过表达NS1和敲除NOLC1的细胞凋亡程度高于单独过表达NS1或敲除NOLC1的细胞，而同时过表达NS1和NOLC1的细胞凋亡程度显著降低，未经转染的细胞和空载转染的细胞被用作阴性对照，并且仅显示少量程度的细胞凋亡，说明NS1的表达促进了细胞凋亡进程，而NOLC1抑制了NS1介导的细胞凋亡反应。综合分析上述研究结果，我们提出以下推断：NS1的外源性表达影响细胞中NOLC1的表达并促进NOLC1磷酸化，磷酸化的NOLC1抑制CK2，使CK2的活性降低，从而减弱CK2对细胞凋亡的抑制作用。我们猜测NS1-NOLC1相互作用通过影响CK2进而影响NF-kB等下游信号通路而改变细胞凋亡进程，具体机制有待进一步研究。