柑橘CBF冷诱导启动子的克隆、筛选及功能研究

柑橘是我国具有国际竞争力的优势农产品之一，但是容易遭受低温冻害。柑橘由于童期长及珠心胚干扰，常规育种培育抗寒性品种的研究进展极为缓慢。采用分子生物学结合基因工程的手段，克隆调控低温抗性的关键基因并进行遗传转化，是创造抗寒性强的柑橘新种质的有效方法。CBF是公认的调控植物抗寒性的关键因子，从抗寒性不同的柑橘中，我们克隆了其CBF转录因子，发现它们在基因序列上虽没有明显的差异，但时空表达特性不同且为冷诱导表达型。经过分析，我们认为可能是CBF基因上游的启动子序列存在差异或对温度的敏感性反应存在差异。基于此，本研究拟以抗寒性不同的柑橘类型为材料，克隆CBF基因上游的调控序列，并将这些调控序列连接报告基因后进行转化研究，在不同的低温逆境下评价这些启动子序列被诱导的条件、敏感温度阀值、表达组织特异性，初步找出影响柑橘抗寒性的关键调控序列、适用于柑橘的冷诱导启动子，为柑橘的抗寒性育种奠定基础。

本项目通过对柑橘CBF类似基因尤其是枳CBF基因启动子序列进行了分离，并进行了详细的生物信息学分析。通过启动子序列顺式作用元件检索分析，针对潜在的顺式作用元件设计带有Pst I和EcoR I酶切位点的引物进行顺序缺失，PCR克隆产物与基本表达载体pCAMBIA1391Z通过大体系双酶切并过柱纯化后，进行连接从而获得7个启动子元件顺序缺失表达载体。转化大肠杆菌DH5a后进行双酶切和PCR双重验证，并进行测序最终确定载体构建成功。提取表达载体DNA，继续转化根癌农杆菌EHA105，从而获得了工程菌株，下一步将进行拟南芥和柠檬转化工作。为了提高拟南芥遗传转化效率，进行了拟南芥前期种植条件摸索实验。同时，开展了柠檬高效遗传转化体系的建立工作，优化了再生体系，并获得了基本表达载体的柠檬转基因植株，进行了PCR初步验证。