NANOG转录调控miR-20a促细胞外基质降解在胸主动脉夹层发生过程中的作用及机制研究

ECM degradation plays a vital role in the development of TAD. MMP2 over-activation is an important reason for ECM degradation and TIMP2 is a secreted protein to inhibit MMP2 activation in normal aorta. We have reported transcription factor NANOG overexpression promoted TAD and further studies based on it showed TIMP2 was down-regulated accompanying with MMP2 over-activation in NANOG overexpression VSMC. Bioinformatic analysis showed miR-17-92 cluster might mediate NANOG induced TIMP2 down-regulation and predicted NANOG binding sites were found in miR-17-92 cluster promoter region. Pilot study found miR-20a in miR-17-92 cluster was high expressed in TAD aorta and sequence alignment of mature miR-20a found a seed-matched sequence within the 3′-UTR of TIMP2. Based on these, we hypothesize that NANOG promotes ECM degradation via up-regulating miR-20a in the pathophysiologic processes of TAD. We plan to do research on clinical samples, cell and TAD mouse model to verify this hypothesis in the present project.

主动脉中层细胞外基质(ECM)降解在胸主动脉夹层(TAD)发生中起重要作用。基质金属蛋白酶2(MMP2)过度激活是导致ECM降解的重要原因，正常主动脉依赖基质金属蛋白酶抑制因子2(TIMP2)抑制MMP2激活以维持动脉壁的生理功能。我们已报道转录因子NANOG过表达是促进TAD发生的重要因素。在此基础上我们发现NANOG过表达平滑肌细胞(VSMC)中TIMP2表达下调，伴随MMP2过度激活。生物信息学分析发现miR-17-92簇可能参与VSMC中NANOG引起的TIMP2下调，其基因启动子区有多个NANOG结合位点。前期研究发现miR-17-92簇中的miR-20a高表达于TAD主动脉，且TIMP2基因3′-UTR区存在其种子序列结合区。基于以上，本项目提出NANOG通过上调miR-20a促ECM降解的机制参与TAD发生的全新假设，并拟通过临床标本检测、细胞及TAD小鼠模型研究对其验证。

项目背景.胸主动脉夹层（Thoracic aortic dissection，TAD）是一种高度致死性主动脉急症。TAD发生时，主动脉内膜出现破口，破口处血液流入导致主动脉撕裂成真假两腔，因假腔内血液无法有效排出不断累积，最终假腔破裂致病人急性死亡。TAD发病率约为0.6‰-1.69‰，考虑到部分病人在死亡前未能明确诊断，TAD的实际发病率可能更高。因TAD的具体发病机制仍然未能完全阐明，目前对TAD尚无有效的预防及药物治疗手段。.主要研究内容.本项目基本按照项目任务书开展工作，通过Weigert弹力纤维染色、qRT-PCR、Western blot、BAPN联合ANGII构建TAD小鼠模型、腺病毒与质粒转染、ChIP以及双荧光素酶报告基因实验等方法对临床TAD标本、血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells, VSMCs)以及小鼠TAD模型进行研究，探究 TAD中主动脉细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)在过表达的转录因子NANOG调控下破坏基质金属蛋白酶抑制因子2(Tissue inhibitors of metalloproteinase 2，TIMP2) - 基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2，MMP2)平衡而发生过度降解这一现象。.重要结果与关键数据.在本研究中我们发现临床TAD主动脉标本中弹力纤维断裂、破坏，伴随弹力蛋白含量降低，提示TAD主动脉中ECM过度降解；TAD主动脉中NANOG、TIMP2过表达并伴随MMP2过度激活；对小鼠TAD模型的检测验证了在临床标本中的发现；进一步在细胞水平的研究发现NANOG可以下调TIMP2表达以及MMP2过度激活，干扰NANOG可以上调TIMP2表达并抑制MMP2激活；本研究还发现NANOG对TIMP-MMP2平衡的调控是通过miR-20a实现的，ChIP实验证实了NANOG对miR-20a的直接调控作用，而双荧光素酶报告基因实验证实了miR-20a对TIMP2的直接抑制作用，这些结果提示VSMCs中NANOG通过miR-20a/TIMP-2通路调节MMP-2的激活。.科学意义.本项目发现了TAD中NANOG通过上调miR-20a抑制TIMP2，促进MMP2激活进而引起ECM降解这一机制参与TAD发生。