芦笋Y染色体性别决定区域基因功能的研究及性别突变体的创制

Asparagus officinalis L., “the king of vegetables”, is a typical dioecious plant. Understanding of the genetic basis of the sex determination in Asparagus officinalis L. provides significant role in elucidating the molecular mechanism of plant sex determination and the origin and evolution of sex chromosomes, as well as the sex controlling breeding of asparagus for high yield and better quality. We identified a non-recombining sex-determining region sized approximately 1Mb on asparagus Y chromosome in our previous international cooperation study. 13 putative lineage-specific hemizygous genes were annotated within this region, among which SOFF was confirmed to be responsible for female suppression and aspTDF1 was hypothesized to be involved in male promotion with no direct evidence. In this study, we will develop a high-efficiency CRISPR/Cas9 system in asparagus for gene editing on the 13 hemizygous genes including SOFF and aspTDF1 and evaluate their function in asparagus sex determination in combination with gene over expression technique. Elected materials with sex variation such as hermaphrodite, asexual and male sterile lines will also be created to assess the value of these hemizygous genes on breeding. Our work will expand the understanding of the genetic basis of asparagus sex determination and provide new techniques and materials for high yield and elite breeding in asparagus.

芦笋属于典型的雌雄异株植物，被誉为“蔬菜之王”。研究芦笋性别决定的遗传基础，对揭示植物性别决定与性染色体起源进化分子机制，有效开展芦笋性别控制育种提高产量和品质，具有重要的意义。我们前期国际合作研究，在Y染色体上鉴定出一个长约1 Mb 非重组的性别决定区域，预测有13个谱系特有半合子基因，其中只有SOFF已被确定负责雌性抑制，aspTDF1被认为有可能促进雄性发育，但缺少直接证据。为此，本项目拟开发高效的芦笋CRISPR/Cas9基因组编辑技术，对包括SOFF与aspTDF1等13个半合子基因进行编辑，并结合基因过量表达技术分析这些基因在芦笋性别决定中的作用。同时，创制一批优良雌雄同体、无性、雄性不育等性别变异材料，评价SOFF与aspTDF1等半合子基因育种价值，旨在进一步揭示芦笋性别决定的遗传基础，为芦笋高产优质育种提供新技术和新材料。

芦笋属于典型的雌雄异株植物，被誉为“蔬菜之王”。研究芦笋性别决定的遗传基础，对揭示植物性别决定与性染色体起源进化分子机制，有效开展芦笋性别控制育种提高产量和品质，具有重要的意义。本研究首先基于拟南芥U6基因的保守性，在芦笋栽培种中克隆获得内源RNA聚合酶III型U6启动子2个：AspU6P3和AspU6P6，用于驱动sgRNA表达，以此分别构建了携带潮霉素或卡那霉素抗性基因的sgRNA和Cas9共表达载体，一共4套；以芦笋株高和茎粗候选基因AoSPL14a为靶基因，构建基因敲除表达载体，并通过芦笋稳定遗传转化体系验证了U6启动子AspU6P3具有高效转录活性，可驱动下游sgRNA的表达，实现了CRISPR/Cas9介导的芦笋AoSPL14a基因靶向编辑，建立了芦笋CRISPR/Cas9基因组高效编辑技术，相关研究结果已获国家发明专利授权。然后构建了芦笋Y染色体包括性别决定基因SOFF与aspTDF1在内的10个SDR基因敲除CRISPR/Cas9表达载体以及SOFF与aspTDF1、SDR236等3个目标基因过表达载体，获得SOFF与aspTDF1、SDR235等3个基因敲除突变体植株，以及SDR232基因敲除愈伤组织、aspTDF1过量表达转基因愈伤组织。SOFF和aspTDF1基因敲除再生植株阳性检测与基因分型结果显示，SOFF和aspTDF1各有1个sgRNA导致靶基因发生编辑，再生植株基因编辑效率分别为36.36%、60.00%。SOFF基因编辑共获得1株纯合突变体和3株嵌合突变体幼苗，共检测出10个突变类型；aspTDF1基因编辑共获得3株嵌合突变体幼苗，共检测出4个突变类型。实现了植物Y染色体非重组区域的半合子基因编辑。研究结果为揭示芦笋性别决定的遗传基础及其分子机制、有效开展性别控制育种，提供了新技术支撑、基因储备和材料基础。