月季花瓣发育中乙烯受体Rh-ETR3互作蛋白的分离及其作用机制探索

Ethylene plays crucial role in flower opening driven by petal-expansion. Ethylene receptor facilites the function of binding ethylene molecule and initiate signal transduction pathway.Our previous works demonstrated that Rh-ETR3 is the predominent receptor for mediating ethylene during petal development in rose.Using the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system, we screened 39 interating protein cadidates of Rh-ETR3. In present work, we try to confirm the interation between cadidate proteins and Rh-ETR3. For convinced interacting proteins, we try to characterize their function by overexpression in Arabidopsis and silencing in rose petals. According to fluorescence co-localization and immuno-copercipitation analysis, we will figure out the interation pattern of Rh-ETR3 and its interacting proteins, and the regulatory mechanism of interacting protein upon ethylene signaling. This work will provide novel evidents to understand underlying post-transcriptional regulation mechanism of Rh-ETR3 in petal development of rose flower. And this work might be contributed to develop and improve post-handling techniques

乙烯是影响月季花朵开放的关键因素，而乙烯受体是结合乙烯分子、开启乙烯信号转导途径的首要环节。申请者的前期工作已经证明Rh-ETR3是月季花瓣生长中控制乙烯响应的主要受体蛋白。通过分裂泛素化酵母双杂交筛选及测序，目前已获得Rh-ETR3候选互作蛋白39个。在此基础上，本项目拟对筛选到的候选互作蛋白进行互作验证，分离其中确实结合并影响Rh-ETR3信号输出的互作蛋白，并对其进行功能鉴定，确定其与Rh-ETR3的互作方式。并探索其在乙烯调节的月季花瓣生长过程中，对乙烯受体Rh-ETR3信号输出的调节模式，进而较为系统地分析月季花瓣内Rh-ETR3蛋白在花瓣生长过程中及响应乙烯过程中的转录后调节机制。项目的实施将为解析乙烯对月季花朵开放的调节机制提供新的试验证据和理论基础。实践上，有望为月季采后性状遗传改良提供基因资源，并可为月季切花新型高效保鲜剂的开发提供依据。

乙烯是调节植物生长发育以及生物和非生物逆境信号应答的重要激素。乙烯受体是感受乙烯的关键蛋白，在植物乙烯敏感性决定和乙烯信号调节中起到了关键作用。月季切花是一种对乙烯非常敏感的观赏作物，其生长发育和采后品质均受到乙烯的显著影响。申请者之前的工作中，鉴定出了月季中感受乙烯的关键受体RhETR3。为探讨RhETR3可能的多重功能及其作用机制，在本项目的支持下，申请者采用分裂泛素化酵母双杂交体系对RhETR3的互作蛋白进行了筛选，一共得到28个确定的互作蛋白，表明RhETR3可能参与多种生化活动。通过BiFC和Co-IP等方法，证实了候选互作蛋白RhTSPO1可以和RhETR3在植物体内发生真实互作。蛋白短截实验表明，RhTSPO1与RhETR3结合发生在跨膜域。同源基因分析表明，TSPO1蛋白与乙烯受体的互作具有物种间的保守性，且只与亚家族II受体互作。进一步的功能分析表明，沉默RhTSPO1可以增加月季花瓣对盐胁迫和干旱胁迫的敏感性；相应地，在拟南芥中的稳定过表达和在月季中的瞬时过表达均显著提高了植株的盐胁迫耐性。有趣的是，在乙烯不敏感突变体ein2-1中过表达RhTSPO1也能显著提高转基因植物的盐胁迫耐性。同时，过表达RhTSPO1并不改变转基因植株的乙烯敏感性。这些结果表明，RhTSPO1与受体的互作介导了乙烯对植物盐胁迫响应的调控，但其作用途径独立于经典的乙烯信号转导途径。乙烯信号可能直接通过调节受体与TSPO类蛋白的互作，直接参与对植株盐胁迫耐性的调节。这一发现对于理解乙烯在植物非生物胁迫响应中的作用机制以及乙烯受体在介导乙烯信号中的作用提供了新的思路，对于植物遗传改良基因工程提供了新的基因资源。