自噬在调节心脏起搏所致心肌损伤中的作用及其机制研究

As a common therapeutic method, cardiac pacing therapy now is widely used in clinic. However, the mechanism of pacing induced complications is still unclear, especially which involved at the cellular level. According to previous studies, autophagy, could not only act as a degradation pathway to modulate the intracellular connexin43 expression, but also could participate into the pathogenesis and development of lots of cardiovascular diseases, including cardiac pacing induced hemodynamic disorder. Our previous work also showed that, in pacing stimulated ventricular myocytes, autophagy flux and Cx43 expression change in dynamic, and interestingly, in totally opposite trends. In order to investigate the effects of autophagy on cardiac pacing induced complications, we first need to establish cardiac pacing models both in vitro and in vivo, with the application of rapid electrical field stimulation and cardiac pacemaker implantation respectively. Then we plan to observe the dynamic change of autophagy activity and to evaluate the Cx43 impairment in the two models. After that, activating and inhibiting the autophagy flux respectively, we intend to record and analyze the corresponding change of Cx43, thus elucidating the regulative effects of autophagy on pacing-induced Cx43 impairment. Results of our research could not only be helpful to elucidate the underlying mechanism of cardiac pacing induced complications, but also could provide potential approaches or new proposals for ameliorating cardiac pacing therapy.

心脏起搏治疗是临床上常用的治疗手段，但对于长期起搏所致心肌损伤的发生机制，目前还尚不明确。既往研究显示，自噬作为能源回收的一种代谢方式，不但能够调节心肌细胞Cx43的结构功能，还参与调节了多种心血管疾病的发生发展，其中就包括心脏起搏所致的血流动力学紊乱。我们之前的工作显示，在起搏模式下的心室肌细胞中，自噬活性和Cx43表达水平呈动态变化，有趣的是，两者变化趋势完全相反。为明确自噬在心脏起搏中的作用，本研究拟借助快速电场刺激和心脏起搏器植入术，建立心脏起搏的细胞和动物模型，以观察起搏条件下细胞和组织内自噬水平的变化，同时观察心肌Cx43受损情况；其后以自噬为调节靶点，分别增强和抑制心脏自噬活性，再观察自噬水平改变后，相应的Cx43变化，以期能够阐述自噬在调节心脏起搏所致Cx43损伤中的机制。本研究的结果不仅有助于揭示心脏起搏相关并发症的发生机制，还可能为心脏起搏治疗的改进提供新的思路。

背景：.心动过速是临床最为常见的心律失常，也是心功能不全等恶性综合征的诱因之一。但是心动过速如何引起心功能不全的原因目前尚不明确。本研究拟通过人源性多能干细胞分化成为心肌细胞，同时予施加快速电场刺激，构建心动过速模型，并尝试探索心动过速导致心功能不全的方式和可能机制。.方法：.培养人源性多能干细胞，并诱导分化成为干细胞分化型心肌细胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, hiPSC-CMs），同时通过电刺激仪予细胞施加1-3Hz的快速电场刺激（rapid electrical stimulation RES），并以RES时间和频率不同分为四组：对照组，高频短时程刺激组（3Hz×8h/天），高频长时程刺激组（3Hz×24h/天）和低频刺激组（1Hz×24h/天）。七天后，收获细胞予进一步检查。以JC-1染色流式细胞分析来检查细胞电刺激后各组之间线粒体功能情况；以Hoechst染色和Annexin V/propidium iodide (AV/PI) 染色流式细胞分析来检查hiPSC-CMs的细胞凋亡情况；通过检测钙瞬变和L型钙通道来评估细胞内钙稳态的情况；并且通过Western blotting和qPCR来检测细胞中凋亡相关基因/蛋白和钙稳态调节基因的表达变化趋势。.结果：.与对照组相比，hiPSC-CMs经高频电刺激后，与对照组和低频电刺激组相比，其线粒体功能明显下降，且凋亡比例明显上升，且钙瞬变振幅和L型钙通道电流也明显下调。分子机制方面的研究显示，RES可使得hiPSC-CMs中Caspase3表达以及Bax/Bcl-2比例明显上调，同时可以使得CaMKII上调。为进一步验证，我们使用CaMKII抑制剂KN93，结果可见其能够逆转RES所带来的不良效果。.结论：.RES可以使得体外心肌细胞 hiPSC-CMs钙稳态失调，并导致内质网应激，从而进一步促进细胞凋亡，并随着时间的改变而导致电生理重构。在这一过程中，CaMKII 扮演着极其关键的作用，CaMKII 抑制剂可以逆转RES的副反应，从而抑制心肌细胞的电生理重构和结构重构。