胚胎干细胞关键因子Oct4和Nanog的RNA结合蛋白的鉴定和研究

Oct4和Nanog是两种维持胚胎干细胞全能性和自我更新的关键转录因子，其表达水平高低直接决定胚胎干细胞的命运；而RNA结合蛋白是转录后水平基因表达调控的主要承担者。为探讨转录后Oct4和Nanog的表达调控机制，本项目拟采用肽核酸辅助的RNA结合蛋白鉴定技术（PAIR）及多维高效液相色谱、高通量生物质谱等仪器，重点实现活体内（in vivo）小鼠胚胎干细胞不同状态的Oct4和Nanog的RNA结合蛋白的鉴定。在此研究基础上，运用免疫沉淀、RT-PCR、免疫细胞化学、改良的电泳迁移和RNA干扰等实验手段对候选RNA结合蛋白进行进一步的验证和功能研究。期望通过本项目的探索研究，发现调控Oct4和Nanog翻译的关键蛋白，进一步揭示胚胎干细胞全能性和自我更新的作用机理。

Oct4和Nanog是两种维持胚胎干细胞（ES）全能性和自我更新的关键转录因子，其表达水平高低直接决定胚胎干细胞的命运；而RNA结合蛋白（RBPs）是转录后水平基因表达调控的主要承担者，目前未见有文献报道Oct4和Nanog的RNA结合蛋白。为探讨转录后Oct4和Nanog的表达调控机制，本课题采用链霉素标签、多维高效液相色谱、高通量生物质谱等仪器和手段实现了小鼠胚胎干细胞Oct4和Nanog的RNA结合蛋白的鉴定，获得了非冗余候选RNA结合蛋白20多个。. 在此研究基础上，运用RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）、免疫印迹（Western Blotting）、RT-PCR等实验手段对候选RNA结合蛋白进行了多种方法的验证，并对其中两个非常重要的RNA结合蛋白（数据未发表，出于保密以RBP1和RBP2替代）进行了功能研究。RNA干扰实验证明，降低RBP1和RBP2的表达时，ES细胞的多潜能因子，如Oct4、Nanog、Sox2和Cldn6的表达均出现了明显的下降，对分化的细胞进行深入的研究发现，小鼠ES细胞主要向中胚层和内胚层分化。与RBP1和RBP2类似，RBP3是鉴定得到的一个Nanog的RNA 结合蛋白，在胚胎发育过程中一直表达，是Lin28mRNA伴侣的翻译抑制因子。在研究中发现，其相互作用的蛋白Cldn6是ES细胞的一个新型表面标志物。作为干细胞表面分选标记，可将畸胎瘤中未分化的干细胞分离出来，经体外干细胞培养条件培养，可形成典型的干细胞克隆，有望成为通适的特异性干细胞表面标志。. 除此之外，我们还应用基因芯片技术考察了Oct4不同表达状态下ES细胞的基因表达谱，并进行了生物信息学分析。结果显示，上调Oct4的表达，有187个基因发生了明显的变化；下调Oct4的表达，有304个基因发生了明显的变化，主要参与的生物学活动有炎症应答、细胞形态改变、转录后修饰、蛋白折叠等。. 综上所述，通过ES关键因子Oct4和Nanog RNA结合蛋白的研究，我们找到了影响Oct4和Nanog转录、翻译的一些重要蛋白质，这些蛋白质直接影响ES细胞的多潜能因子的表达，进而影响ES细胞的多潜能特性和分化趋势，为进一步揭示胚胎干细胞全能性和自我更新的作用机理提供了理论依据。