我国芸薹根肿菌生理小种鉴定及分子标记研究

Clubroot of cruciferous plants caused by Plasmodiophora brassicae is an important soil-borne disease. As resting spores of the pathogen can survive for a long period of time, the disease is difficult to control. Effective deployment of clubroot-resistant varieties is now considered essential to control the disease. For this purpose, characterization of the physiological races or pathotypes is essential and important. However, the knowledge of physiological races or pathotypes of P. brassicae is limited and no molecular markers related to physiological races were reported in China. The subjects of this program are to test the physiological races or pathotypes of Chinese collections of P. brassicae and to establish pathotype specific molecular markers. The project is initiated by single-spore isolation of of P. brassicae collections. Physiological races or pathotypes of progenies of single-spore isolates will be determined by Williams systems. SCAR markers will be obtained by screening from random primers and SNP markers will be developed according to differences in sequence of DNA fragments amplified with primers designed according to the clubroot EST sequences from GenBank. The results will establish a new method for subspecies detection of P. brassicae, and provide theoretical basis for breeding and rational deployment of clubroot-resistant plants.

芸薹根肿菌引起的根肿病是十字花科作物上重要的土传病害。由于病原产生的休眠孢子在土壤中存活期较长，病害防治困难。合理布局抗病品种是根肿病防治的最简便可行的方法。目前，对于我国各地分布的芸薹根肿菌生理小种（或致病型）类型还不明确，与生理小种相关的分子标记工作尚未见研究报道。鉴此，本项目提出在收集我国不同地理区域的根肿病样品的基础上，通过单孢分离获得纯培养物，采用Williams系统的鉴别寄主鉴定各分离物生理小种（或致病型）归属，并明确不同生理小种（或致病型）分布；采用SCAR标记和SNP标记的工作原理，发展能区分不同生理小种（或致病型）的SCAR标记和SNP标记。项目的完成将明确我国芸薹根肿菌生理小种（致病型）类群及其分布规律，建立快速准确区分芸薹根肿菌不同生理小种（或致病型）的分子标记。为抗根肿病育种提供技术支持，为抗病品种合理布局提供理论依据。

本项目研究了我国不同地理来源的芸薹根肿菌的致病力差异和种内多态性。.首先，建立了芸薹根肿菌单孢分离、显微观察、菌株繁殖的培养体系以及根肿菌DNA提取的方法。采用微量菌液法（1个孢子/0.5 μl）对根肿菌进行单孢分离，共获得15个单孢分离株。单孢的致病力较弱，平均发病率仅为2.14%。采用改良的CTAB法、硅藻土法和玻璃珠法从根肿菌休眠孢子液中提取根肿菌的DNA，结果表明玻璃珠法提取的DNA去杂效果好，浓度高，操作简单且用时短。.其次，筛选了12个抗根肿病大白菜品种，可作为鉴别寄主用于鉴定我国的根肿菌菌株的致病型。利用这些抗病白菜明确了我国不同地理来源的芸薹根肿菌的致病力差异。.最后，明确了我国不同根肿菌菌株的种内多态性。利用RAPD随机引物获得不同菌株之间的谱带差异，但这些差异性谱带与根肿菌的生理小种之间并没有显著的相关性。分析了β微管蛋白（β-tub）、多聚泛素蛋白（ubq）、肌动蛋白（act）和核糖体DNA（rDNA）序列，结果表明：44个根肿菌菌株rDNA的28S基因序列保守性高，β-tub、ubq和act基因序列变异也很小，但43个菌株的18S基因和42个菌株的18S-ITS4区域的序列检测到较大的片段缺失，缺失片段大小分别为378bp和479bp。项目中检测到的序列变异（缺失/插入）暗示研究根肿菌种内遗传多样性的意义重大，虽然这些变异与菌株的致病型之间的关系并不明确，但却可以对不同致病力的菌株进行更详细的划分。研究结果将为根肿病的抗病育种奠定理论基础。项目资助发表论文3篇，其中SCI 2篇。