等离子体质谱用于磷酸化蛋白定量分析中的芯片富集技术研究

In the field of phosphoproteomics, analytical methods with high sentisitivity and high sample throughput are urgently expected for the quantitative analysis of phosphoproteins. To address this challenge, a new strategy of chip based enrichment technique combined with high performance liquid chromatography - inductively coupled plasma mass spectrometry (HPLC-ICP-MS) for the quantitative analysis of phosphoproteins is proposed in this project. The proposed project aims to prepare monolith and magnetic nanoparticles with good adsorption efficiency for the enrichment of phosphopeptides,to design highly integrated microfluidic chips suitable for solid phase microextraction (SPME), to optimize the operation conditions of capillary HPLC-ICP-MS and to establish the method of chip based SPME-HPLC-ICP-MS for the absolute quantification of phosphopeptides by the determination of element P. The developed method will be applied in cell sample for phosphoprotein quantitative analysis to study the relationship between protein phosphorylation and life functions. The fulfillment of the project will provide efficient analytical techniques and relative information for phosphoproteomics, widen the application field of ICP-MS in protein quantification. It will be of both academic significance for the development of analytical chemistry (especially atomic spectrometry / mass spectrometry) and broad application prospect.

建立高灵敏、高通量、快速的磷酸化蛋白质定量分析方法是磷酸化蛋白质组学研究领域中的热点与难点。本项目拟提出开发新型芯片富集技术，并将其与高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)联用用于磷酸化蛋白质的定量分析研究。制备吸附性能优良的整体柱和磁性纳米材料用于磷酸化肽段的富集，设计适于固相萃取的高集成化微流控芯片，优化毛细管HPLC-ICP-MS分离检测条件，建立芯片固相微萃取-HPLC-ICP-MS分析方法，通过对元素P的定量测定实现对磷酸化肽段的绝对定量分析，并将所建立的方法用于细胞样品中磷酸化蛋白质的定量分析，探讨蛋白质磷酸化与生命功能之间的关系。该课题的完成不仅可以提供磷酸化蛋白质组学相关信息，拓宽ICP-MS技术的应用领域，提供重要的科学实验数据，而且对于分析化学学科（特别是原子光谱/质谱）的发展和学术水平的提高，均具有重要的学术意义，并具有广阔的应用前景。

建立高灵敏度、高选择性、高准确性的蛋白质定量方法是当前定量蛋白质组学中的重要发展方向。芯片预富集技术具有快速、微量和集成化高等优点，尤其适合生物分析；基于等离子体质谱(ICP-MS)检测的元素标记蛋白质定量方法具有灵敏、多目标同时分析、耐基质能力强等特点，具有很大的发展潜力。本项目旨在开发新型芯片固相微萃取技术，并与ICP-MS联用技术相结合，建立适用于磷酸化蛋白质定量分析的新方法。项目主要研究内容包括：1、制备了一系列新型适合于固载在微流控芯片通道中的整体柱材料(包括TiO2整体柱、TiO2纳米材料(NPs)功能化的甲基丙烯酸整体柱和含吡啶基团的甲基丙烯酰胺整体柱等)和磁性纳米材料(包括TiO2、壳聚糖、氧化石墨烯、离子液体、有机金属骨架化合物改性磁材料和印迹磁材料等)。以中空纤维膜(HF)为支撑体制备了TiO2整体柱，有效解决了TiO2整体柱在制备过程中易收缩，与管壁结合不牢的问题。该整体柱对磷酸化肽段萃取效率高、选择性好。2、建立了芯片磁固相微萃取/芯片整体柱微萃取-ICP-MS联用新方法用于磷酸化肽段、痕量元素及其形态的分析检测。在外加磁场下，将Fe3O4@TiO2磁材料自组装于芯片微通道中，制作了用于磷酸化肽段预富集的微流控芯片，将其与毛细管高效液相色谱-ICP-MS联用，实现了人血清中磷酸化蛋白质的定量分析。3、进一步开发了其他新型元素标记探针(金属络合聚合物、Au NPs和Ag NPs标签)，将元素标记ICP-MS蛋白质定量方法拓展至糖蛋白和细胞凋亡标志物分析及细胞计数。4、将所建立的ICP-MS联用技术用于CdSe量子点诱发的细胞毒性研究。初步研究了CdSe量子点(QDs)培育HepG2细胞中QDs的迁移转化行为，发现了CdSe QDs在HepG2细胞中主要以两种形态存在：类似量子点形态和含Cd金属硫蛋白。以上研究不仅为蛋白质定量分析(尤其是磷酸化蛋白质分析)提供了实验方法和基础数据，同时展现了ICP-MS联用技术在生物分析中巨大的应用潜力，这对于分析化学学科(特别是原子光谱/质谱)的发展和学术水平的提供，均具有重要的学术意义。