HCV包膜蛋白与CLDN1，OCLN受体关键结合位点的研究

HCV entry is the first step of virus-host cell interactions leading to productive infection and thus is a promising target for antiviral therapy. CLDN1 and OCLN are critical host cell factors for HCV entry, probably during a post-binding step. Recent studies suggest that CLDN1 associates to CD81 and OCLN is responsible for the species specificity of HCV, however,the precise roles of CLDN1 and OCLN in HCV entry have not been completely understand. In this proposal, we will design and screen a library of overlapping peptides covering HCV envelope glycoproteins E1E2 to identify the critical binding sites of ClDN1/OCLN on HCV E1E2. Our findings may contribute to better understanding the molecular mechanisms of CLDN1/OCLN mediated HCV entry，and thus facilitate the development of HCV antiviral therapy.

HCV入侵是其在宿主细胞内建立感染的首要环节，是抗病毒治疗的重要潜在靶点。CLDN1和OCLN均是HCV非常重要的受体，可能在HCV入侵的晚期发挥重要作用。 CLDN1与CD81可以互作形成复合体， OCLN与HCV感染的种属特异性有关，但是目前其在HCV入侵过程中具体作用机制仍不清楚。因此，本项目拟在前期研究基础上，根据H77株HCV包膜蛋白E1E2设计合成覆盖全部包膜蛋白的多肽文库，筛选出HCV包膜蛋白与CLDN1，OCLN的关键结合位点，探索该位点对包膜蛋白的表达及二聚体的形成、与CD81、SR-BI、CLDN1和OCLN等关键受体的相互作用，及入侵过程中膜融合能力的影响，为进一步阐明CLDN1和OCLN介导HCV侵入感染的机制奠定一定理论基础，对HCV抗病毒药物和保护性疫苗的研究开发具有重要的科学意义。

HCV是世界上导致慢性肝脏疾病的主要病原体之一，通常会导致肝纤维化，肝硬化，肝细胞肝癌等。但是针对于HCV的疫苗目前仍未上市。而现在针对于HCV的抗病毒药物（DAAs）能够得到比较满意的持续病毒应答率，但是该治疗方法仍有病毒耐受，治疗周期长，药物不良反应以及治疗费用昂贵等缺点。DAAs药物主要是在HCV复制阶段发挥阻断作用，而HCV受体类似物可以作为一种新型的HCV入侵的抑制剂，对HCV的治疗起到协同作用。OCLN是HCV的重要受体之一，且具有种属特异性。我们基于HIV的gp41蛋白在融合构象的六螺旋束模型，构建一个六螺旋束的骨架结构，在此基础上，将OCLN的ECL1和ECL2两个胞外环进行不同组合后装配到六螺旋束骨架之上，这些OCLN胞外环的融合蛋白成功克隆并进行体外表达和纯化。我们得出了双环构建蛋白的D1ECL1S+D2ECL2构建能够在没有细胞毒性条件下抑制HCV入侵效果最好。蛋白生物物理活性检测，D1ECL1S+D2ECL2的构建与理论一致，改变了骨架蛋白的二级结构；热变性实验发现该蛋白结构比较稳定，解螺旋温度约为89.09°C。抗病毒作用时间点(time of addition)实验证明D1ECL1S+D2ECLS主要是在HCV入侵的早期发挥作用。D1ECL1S+D2ECL2作用机制主要是与HCV病毒粒子相互结合，从而抑制HCV的入侵，这与我们的实验构想相一致。利用HCV假病毒的实验平台，我们得到D1ECL1S+D2ECL2对HCV的抑制作用具有广谱性。综上所述，本研究发现一种针对HCV入侵的广谱抑制剂，对DAAs药物的治疗可能起到协同作用。