研究尼古丁对小鼠精子mRNA及非编码RNA的影响

精子中存在一群复杂的RNA群体，这些RNA是否会受外界环境因素的影响而发生改变，这种改变是否会对生殖和胚胎早期发育发挥作用令人关注。为了更全面的解读这一特有的RNA群体，我们拟采用SAGE方法，构建尼古丁处理前后小鼠精子的RNA的SAGE数据库。分析这两个SAGE库中RNA标签的种类和丰度的差异。对有差异的mRNA标签进行功能分析；对未知标签则采用rSAGE、RT-PCR、RACE等方法，获得这些未知标签的mRNA的全长，以及期待能够发现新的基因，包括非编码调控基因。再结合生物信息学，Norther-blot、原位杂交等方法，分析这些未知基因的功能，探讨尼古丁对精子RNA群种类和丰度的影响，以及在不同组织中的差异表达情况。最后再运用反义RNA等方法，探讨这些基因在胚胎发育过程中的作用，从而解释吸烟影响精子中发育、影响胚胎发育的分子机制，进而探究RNA分子的表观遗传学的机理。

已有报道吸烟对人的生殖和胚胎发育过程产生不良影响，但其分子机理不清楚。由于精子中存在一群复杂且稳定的RNA群体，我们拟从研究热点且未知的精子RNA谱角度来分析这些RNA是否会受外界环境因素（香烟烟雾）影响而发生改变，以及这种改变是否与生殖和胚胎早期发育有关联。为此首先我们建立了小鼠尼古丁模型，并分析了尼古丁处理前后小鼠精液质量，子代出生率及睾丸组织切片的形态学分析；其次采用RNA Seq高通量测序方法对两组小鼠精子细胞进行深度测序，构建尼古丁处理前后小鼠精子的RNA谱数据库。先利用生物信息学方法对表达谱整体性分析，然后结合RealTime-PCR法验证并确定出差异较大且高丰度的RNA群进行后续的功能聚类及Pathway等方面分析；最后，选择功能聚类中与精子发生、成熟及胚胎早期发育相关的RNA组分用实验方法进行后续功能分析。已有结果表明：1、小鼠尼古丁处理5周模型结果分析，尼古丁处理后小鼠精子数量，形态变化及运动的变化，显示精液质量有所下降，小鼠子代的出生率，存活率较低，以及睾丸组织中生精小管管壁变得疏松，生精上皮脱落、变薄；2、RNA Seq 测序获得两库中原始RNA标签近3万种RNA（正常组33727种和尼古丁处理组29595种）。总RNA谱中，绝大数是mRNA占（85%），余下是非编RNA；3、RealTime-PCR验证并剔除测序中一些低丰度背景噪音，筛选出尼古丁处理前后高表达且差异较大（≥1.5倍）mRNA 6439种。对这群RNA进行生物信息学功能聚类及pathway等分析，归纳出受尼古丁处理影响且与精子发生、成熟及胚胎早期发育直接有关的RNA 11种；4、选定11种直接相关的RNA中高表达的5个基因在mRNA及蛋白水平上进行组织表达特异性分析，发现其中一个基因特异性表达于睾丸组织。对其免疫组化及电镜分析，发现该基因特异性定位于精子发生过程中减数分裂及顶体形成过程中，其蛋白特异性表达与精子的顶体部位。免疫沉淀结果显示，该蛋白与cadherin相关作用，后续的Knockout小鼠正在构建。初步结论：尼古丁处理后，小鼠精液质量及子代出生率和存活率均出现下降，睾丸组织发生松散性病变。可能的分子机制是，尼古丁影响精子发生、成熟等过程的基因表达调控，尤其是顶体形成及功能有关，该影响体现在精子中RNA谱特征发生变化。详细机制需要后续实研究证实。