母体循环中胎儿表观遗传学信息靶标的筛选与检测

胎儿亲子鉴定是法医学亲子鉴定实践的重要部分。传统的鉴定方法均为有创性，对胎儿和孕妇会造成一定的危险。新近研究结果提示：母体血浆中母源性与胎源性DNA之间存在差异甲基化位点，使用甲基化技术能将两者有效区分；联合利用位点内的SNP标记，还能对胎儿DNA成分进行SNP分型，有望实现无创性胎儿亲子鉴定。但系统的母胎DNA甲基化差异位点尚未明确。因此，本课题拟采用高通量甲基化芯片，以母体血液细胞（MBC）和胎盘绒毛膜（CVS）为研究对象，系统检测母胎DNA的差异甲基化谱；从中选择若干含SNP标记的胎儿特异高甲基化位点，利用实时PCR、甲基化特异性PCR（MSP）等技术进行大样本分析，以确定这些位点在MBC和 CVS中的甲基化模式；并在母体血浆中作进一步验证，评价其作为母体循环中胎儿表观遗传学标记物的特异性、稳定性与灵敏度，期望为建立无创性胎儿亲子鉴定以及其他产前诊断方法提供有参考价值的线索。

新近研究表明，母体与胎儿组织DNA之间在存在甲基化位点，联合利用差异甲基化位点及其附近的SNP 标记，可对母体血浆中胎儿DNA 成分进行分离和SNP 分型。由于该技术目前主要应用于胎儿三体综合征的无创性产前诊断研究中，因此研究重点一直在三体多发的13、18、21 号染色体上。本课题采用高通量的450K甲基化芯片（美国Illumina公司），以母体血液细胞（MBC）和胎盘绒毛膜（CVS）为研究对象，在全基因组范围内系统检测母胎DNA 的差异甲基化谱。芯片结果显示，在早、晚期母胎样品中各有2, 944和5, 218个胎儿特异性高甲基化CpG位点，其中2, 613个CpG位点在早、晚期中均呈胎儿特异性高甲基化状态，满足本研究所需。基于芯片结果，我们试验性的挑选10个共含有27个阳性CpG位点的候选序列，采用亚硫酸氢盐处理后测序（BSP）进行验证。选择条件为：1、多个母胎甲基化差异CpG位点位于一段短DNA片段中；2、目的片段有两个以上的甲基化敏感性内切酶（MRSE）HinP1I 或HpaII的识别位点；3、目的片段中含1个以上多态性良好的SNP位点。结果提示，BSP验证与芯片筛选结果基本一致。最后，我们采用MSRE-PCR技术，对PSMB8, SKI and CHST11等三个候选标记物在孕妇血浆中的特异性作了进一步的验证，结果显示高甲基化目的序列只存在于孕妇血浆中，而在非孕妇中均未检出；SNP分型表明，孕妇血浆高甲基化目的片段中的SNP分型与相应的胎儿组织DNA分型一致，进一步证实母体血浆中的高甲基化序列来自于胎儿。本项目为在全基因组范围内研究母体循环中胎儿表观遗传学标记物提供了新的试验数据和可靠的研究方法，建立了一种对胎儿进行SNP分型的无创性方法，有望为建立无创性胎儿亲子鉴定以及其他产前诊断方法提供有参考价值的线索。