不同Connexin亚型对生物起搏频率的影响及其实验研究

Biological pacemaker has become a significant innovation for the treatment of bradyarrhythmia in recent years. However, the low frequency of biological pacing turned out to be the critical issue which impedes its advancement. We have found that lacking of proper gap junctions might be the important reason in our previous study. However, the influence of difference gap junctions on pacing frequency remains unclear. Studies show that there are three subtypes of connexin (Cx) in heart. In the current project, the abilities of conduction and protection for frequency would be tested to screen out the optimal subtype of connexins in vitro. In vivo, we will investigate the influence on biological pacing of chosen Cx subtype, and explore the method for improving long-term outcome of biological pacing. If a success is made, it will be promising to solve the bottleneck issue for the research of biological pacing, provide the theoretical and experimental foundations for the building of biological pacemaker and promote the process of its clinical applications.

近年来，生物心脏起搏器是缓慢型心律失常治疗领域的重大创新性课题。截至目前，生物起搏频率缓慢的问题已成为制约其发展的主要瓶颈。我们通过前一基金项目的研究发现，缺少适宜的缝隙连接可能是目前生物起搏频率缓慢的重要原因。然而，不同缝隙连接类型对生物起搏频率的影响及其区别目前尚不清楚。现已明确，心脏内分布有三种亚型的缝隙连接蛋白（Connexin，Cx）。在本项目中，我们拟通过体外细胞实验比较不同缝隙连接类型的传导性与频率保护作用，从而筛选出理想的Cx亚型；再通过动物体内实验，评价特异性表达该Cx亚型对生物起搏频率的影响，并探索提高生物起搏远期效果的方法和技术。如获成功，将有望从根本上解决当前生物起搏研究中的瓶颈问题，为生物起搏器的研发提供理论和实验依据，从而加快其临床应用进程。

缓慢型心律失常包括病窦综合征及各类心脏传导阻滞等，是一类严重威胁人类健康的心脏疾病。近年来，生物心脏起搏器逐渐成为缓慢型心律失常治疗领域新的研究方向，其可行性已经得到充分的证明。目前生物起搏的频率及其稳定性问题是制约这一技术应用于临床的主要瓶颈。我们的前期研究发现，缺少适宜的缝隙连接可能是目前生物起搏频率缓慢的重要原因。.在本项目中，我们首先利用基因技术和干细胞技术分别构建了表达不同Cx亚型的人工起搏细胞（Lenti.Cx40.HCN4-MSCs, Lenti.Cx43.HCN4-MSCs, Lenti.Cx45.HCN4-MSCs），并分别与乳鼠心肌细胞混合培养，比较各组的起搏频率、起搏电流强度等的差异，结果发现，与Lenti.Cx45.HCN4-MSCs混合培养的乳鼠心肌细胞的起搏频率、起搏电流强度明显优于其它两组（P<0.05），提示缝隙连接蛋白亚型Cx45对于生物起搏信号具有更好的传导性和频率保护作用。在动物体内实验中，我们首先构建了健康成年雄性小型猪不同类型的人工起搏细胞（Lenti.Cx45.HCN4-MSCs, Lenti.HCN4-MSCs, Ad.HCN4-MSCs），并分别自体移植到完全性房室传导阻滞猪的右心室前壁心肌内。移植后第4周，各组心室率分别为(85.3±7.5)BPM,（62.3±6.1）BPM和(65.2±2.7)BPM。至移植后第12周，Lenti.Cx45.HCN4-MSCs组和Lenti.HCN4-MSCs组心率分别为(76.2±8.3)BPM和（59.8±6.2）BPM（P<0.05），Ad.HCN4-MSCs组心率全部为电子起搏心率（40BPM）。至移植后第24周，Lenti.Cx45.HCN4-MSCs组和Lenti.HCN4-MSCs组心率分别为(56.2±5.7)BPM和（50.3±3.4）BPM（P<0.05）。以上结果提示起搏基因HCN4共表达Cx45可以有效提高生物起搏频率，并基本可以达到临床起搏治疗所需的频率。此外，慢病毒载体技术可以有效提高生物起搏的有效时限，然而在6个月后起搏频率明显下降，提示起搏蛋白的表达下降，导致生物起搏频率减慢，因此对于这一技术的远期效果提升仍需要对基因载体技术进行进一步的尝试和探索，以实现永久性的生物起搏效果。