多基因簇参与的焦曲霉二倍半萜ophiobolin生物合成机制研究

Terpenoids are the most diverse and abundant natural products among which artemisinin and paclitaxel are well known antimalarial and anticancer drugs. Ophiobolins are tricyclic 5-8-5 ring sesterterpenes with potential therapeutic application in drug resistent breast cancer, glioma as well as Parkinson’s disease. Involvement of five gene clusters in ophiobolin synthesis was found in Aspergillus ustus 094102 isolated from mangrove rizhosphare, which is an unususal biosynthesis pathway. In this project, using a combined strategy of gene knockout by CRISPR/CAS9 system, gene expression and in vitro verification, together with pathway reconstruction in E. coli chassis, we will illuminate this unique multiple gene clusters involved terpene biosynthesis mechanism and symutanously, construct a heterologus ophiobolin biosynthesis system in E. coli, which will be of significant application in large amount production of ophiobolin compound.

萜类化合物是天然产物中化学结构多样性最丰富的家族,包括抗疟药物青蒿素及抗癌药物紫杉醇。Ophiobolins(Ophs）是一种5-8-5环二倍半萜，对阿霉素耐药乳腺癌有增敏作用，对脑胶质瘤、帕金森症等疾病有潜在疗效。阐明Ophs的生物合成机制对大量制备该化合物有重要意义。前期研究发现在红树林真菌焦曲霉094102中，Ophs的合成至少与五个基因簇相关，与通常一个基因簇负责一种化合物骨架合成有很大区别。本研究将通过CRISPR/CAS9基因敲除、蛋白表达与体外反应等方法，对参与Ophs生物合成的相关基因进行功能鉴定, 结合大肠杆菌底盘系统重建Ophs合成途径，解析来自不同基因簇的基因对Ophs合成的影响。目的是揭示一种多基因簇参与的萜类化合物生物合成模式，同时建立大肠杆菌底盘的Ophs合成体系，为生物合成法大量制备Ophs奠定基础。

二倍半萜是萜类化合物中的稀有类型，蛇孢菌素是一种具有抗肿瘤耐药、抗病毒等活性的二倍半萜，前期研究发现其生物合成涉及多个基因簇。本项目通过转录组分析、基因敲除和异源表达以及合成生物学系统表达蛋白及体外试验，确定了Aspergillus ustus 094102中ophs合成基因簇POC8003的边界及基因簇外的全局性调控基因和氧化后修饰基因。确定了三个关联途径POC13192，POC 11565，POC 3446中的三个萜类合成酶的功能分别为两个嵌合型二萜合成酶，及一个六异戊烯基焦磷酸合成酶；在大肠杆菌中重建了以Au8003为核心的多基因表达系统，通过增加前体供应、蛋白质工程优化和发酵条件优化，多基因联合增效，在大肠杆菌中达到了蛇孢菌素合成的最高水平150 mg/L。本研究为蛇孢菌素的大量制备和进入临床研究奠定基础，也为认识二倍半萜的复杂生物合成机制提供了重要的科学价值。