ZNF580基因过表达对颈动脉球囊损伤后内皮修复的作用及其分子机制研究

内皮损伤是动脉球囊扩张支架术后再狭窄的始动环节,促进内皮修复是防止再狭窄的新策略。本组研究证实锌指基因ZNF580过表达可上调内皮细胞MMP-2及VEGF表达并促进其迁移增殖。为揭示ZNF580促进内皮细胞迁移增殖和影响内皮修复的相关基因及蛋白调控网络，拟复制大鼠颈动脉球囊损伤模型，损伤局部转染重组腺病毒载体pAdEasy-ZNF580-GFP，研究ZNF580基因过表达对大鼠颈动脉内皮修复的作用。应用基因芯片及同位素标记蛋白定量技术研究颈动脉内皮修复过程中基因表达谱、蛋白表达谱的变化；研究稳定过表达ZNF580内皮细胞株蛋白表达谱的改变，染色质免疫共沉淀测序分析ZNF580所调控的DNA靶序列；应用酵母双杂交筛选人主动脉cDNA文库钓取与ZNF580相互作用的蛋白，并在HEK293细胞内验证。生物信息学分析相关基因、蛋白的功能及相关信号转导通路。为应用ZNF580防治再狭窄提供实验依据。

促进动脉血管内皮修复、抑制平滑肌细胞（VSMC）增殖是防治支架术后再狭窄的关键。为研究本组克隆ZNF580/ZFP580锌指基因促进内皮修复、抑制VSMC增殖的相关基因与蛋白调控网络，本课题应用大鼠颈动脉球囊损伤模型，证实过表达ZNF580基因可以抑制损伤后内膜的过度增生，减轻再狭窄的发生，并探讨了ZNF580/ZFP580基因抑制再狭窄的分子机制。通过免疫荧光双染及流式细胞术等一系列实验，证实ZFP580过表达可以促进内皮祖细胞（EPCs）表面标记物分子CD31、vWF、eNOS的表达，抑制干细胞标记物CD133的表达，同时体内外血管生成能力增强，表明过表达ZFP580可促进EPCs向成熟内皮细胞分化，而应用eNOS抑制剂L-NAME干扰后，ZFP580诱导EPCs分化作用显著降低，表明ZFP580可能是通过eNOS/NO信号途径调控EPCs的分化。在人脐静脉内皮细胞株（EA.hy926）中，证实TGF-β可诱导ZNF580和eNOS的表达呈现先下降后上升的趋势，其中2 ng/ml TGF-β作用6 h后，ZNF580和eNOS的表达最低，而TGF-β受体的特异性阻断剂SB431542可抑制上述趋势。通过Luciferase实验证实ZNF580可增强下游靶基因eNOS启动子的转录活性，免疫荧光实验证实TGF-β可使Smad2核转位增强，导致ZNF580的表达降低，而ZNF580过表达可上调其下游靶基因eNOS的表达，拮抗TGF-β对EA.hy926细胞迁移和增殖的抑制作用。表明ZNF580通过TGF-β1/ALK5/Smad2信号转导通路调控内皮细胞稳态。通过BrdU掺入实验和Transwell迁移等实验研究表明过表达ZNF580基因可以抑制VSMC细胞增殖和迁移能力，利用全基因组芯片和蛋白芯片分析了ZNF580过表达后VSMC基因表达谱及相关蛋白因子的变化，深入研究了ZNF580基因影响VSMC增殖和迁移的分子机制和调控的信号网络。本课题通过一系列实验阐明ZNF580/ZFP580可通过促进EPCs向内皮分化以及内皮细胞的增殖和迁移，抑制VSMC增殖和迁移，进而促进损伤后血管内皮修复，抑制内膜的过度增生，为支架术后再狭窄的基因治疗提供了新的科学依据。