EPAC-Syntaxin相互作用调控谷氨酸释放参与癫痫发作的机制研究

The important reason of epileptic seizures is the neural excitotoxicity result from the excessive release of presynaptic glutamate. However, the mechanism of glutamate release remains unclear. EPAC (Exchange Proteins Activated by cAMP) belongs to a novel class of cAMP receptors. Both EPAC1 and EPAC2 proteins are expressed throughout the brain, including in the hippocampus, striatum, and prefrontal cortex. Our previous study first showed that combined deletion of both the EPAC1 and EPAC2 genes (EPAC-/-) reduced glutamate release from the presynaptic terminals and decreased vulnerability to epileptic seizures. We also described ATP-sensitive potassium(KATP) channels was inhibited by the interaction of EPAC2351–45 and KATP subunit type-1 sulfonylurea receptor (SUR1) SUR1859–881, which increased calcium dependent glutamate release from the presynaptic terminals. In addition, we also found that EPAC interacted with synaptic vesicle fusion protein Syntaxin in hippocampus of adult mice. Whether EPAC interfere synaptic vesicle fusion through interaction with Syntaxin then regulate glutamate release is unclear. Based on these information, this project intends to explore the molecular mechanisms of EPAC-Syntaxin interaction involved in acute epileptic seizures by regulate glutamate release and whether it attenuates the seizures pathological behavioral deficits by blocking the interaction of EPAC-Syntaxin. This project displays theoretical and practical significance in facilitating understanding of the mechanisms of epileptic seizures and discovers new target molecules for epileptic seizures.

突触前谷氨酸释放过多引起的神经兴奋性毒性是癫痫发作的一个重要原因, 但是调节谷氨酸释放的分子机制仍不清楚。EPAC属于一类新的cAMP受体家族，在全脑呈广泛性表达，包括海马，纹状体和前脑。前期研究首次发现EPAC敲除小鼠[EPAC-/-]突触前谷氨酸释放减少，癫痫发作易感性明显降低；EPAC2和ATP敏感的钾离子通道组成蛋白SUR1相互作用增加钙离子依赖的谷氨酸释放。免疫共沉淀结果提示EPAC2和突触囊泡蛋白Syntaxin存在相互作用。EPAC能否通过Syntaxin影响突触囊泡融合进而调控谷氨酸释放还不清楚。本课题拟研究EPAC-Syntaxin相互作用调控谷氨酸释放进而参与癫痫急性发作的分子机制以及干预其相互作用缓解癫痫发作的治疗效果。本课题首次探讨EPAC通过和突触囊泡蛋白相互作用影响谷氨酸释放参与调控癫痫发作的分子机理，将为控制癫痫急性发作和开发小分子抗癫痫药物提供新的策略。

突触前谷氨酸释放过多引起的神经兴奋性毒性是癫痫发作的一个重要原因, 但是调节谷氨酸释放的分子机制仍不清楚。EPAC属于一类新的cAMP受体家族，在全脑呈广泛性表达，包括海马、纹状体和前脑，参与多种神经生理功能。Syntaxin属于突触囊泡融合蛋白，特异性表达于神经元细胞，对于突触前神经递质的释放有重要作用。前期研究首次发现EPAC敲除小鼠[EPAC-/-]突触前谷氨酸释放减少，癫痫发作易感性明显降低；EPAC2和ATP敏感的钾离子通道组成蛋白SUR1相互作用 增加钙离子依赖的谷氨酸释放。免疫共沉淀结果提示EPAC2和突触囊泡蛋白Syntaxin存在相互作用。EPAC能否通过Syntaxin影响突触囊泡融合进而调控谷氨酸释放还不清楚。本课题利用多种分子生物学技术研究了EPAC-Syntaxin相互作用调控谷氨酸释放进而参与癫痫急性发作的分子机制以及干预其相互作用缓解癫痫发作的治疗效果。研究结果显示：1. EPAC敲除抑制了突触前谷氨酸的释放。2. EPAC敲除对突触囊泡蛋白表达水平和突触的形态无显著性影响。3. EPAC和Syntaxin在小鼠脑中存在共定位。4. 确认EPAC-Syntaxin相互作用的关键序列氨基酸，并且在体内外验证了外源性Syntaxin关键氨基酸序能够阻断EPAC-Syntaxin的相互作用。5. 小鼠癫痫发作时EPAC和Syntaxin的蛋白水平无明显变化，但是相互作用显著性增加。6. 体内阻断EPAC-Syntaxin相互作用显著性减少脑内谷氨酸浓度和癫痫发作指数。 以上结果证实了EPAC通过体内EPAC-Syntaxin的信号通路参与了突触前谷氨酸的释放的生理过程。体外重组表达的Syntaxin小分子能够在体内阻断EPAC-Syntaxin相互作用而缓解癫痫的急性发作。本课题首次探讨EPAC通过和突触囊泡蛋白相互作用影响谷氨酸释放参与调控癫痫发作的分子机理，将为控制癫痫急性发作和开发小分子抗癫痫药物提供新的策略。