异体软骨与自体骨髓间质干细胞构建全喉框架及移植修复全喉缺损的实验研究

全喉切除后功能重建的基础是重建全喉框架。本研究采用我们已建立的改良灌注去细胞方法，去除同种异体供体喉具有高免疫原性的软组织如喉肌和黏膜细胞，保留其软骨活性，再结合自体骨髓间质干细胞调控、显微注射、体内埋植带蒂血管化等技术，对供体喉进行生物重建，整体构建一种由异体软骨三维框架与自体细胞组合而成的全喉框架。原位移植于全喉缺损处后，用内窥镜、声图分析、组织病理、免疫组化、分子免疫检测等方法研究生物改建后的喉框架在呼吸、吞咽保护、发音方面的功能恢复及免疫排斥反应。阐明同种异体喉框架生物改建的方法与机理，为全喉切除后喉功能的重建探索新方法。

全喉切除后功能重建的基础是重建全喉框架。本研究用改良的灌注去细胞方法，去除同种异体供体喉中具有高免疫原性的组织如喉肌和黏膜细胞，保留其软骨活性，并采用自体骨髓间质干细胞调控、显微注射、体内埋植带蒂血管化等技术，对供体喉进行生物重建，整体构建一种由异体软骨三维框架与自体细胞组合而成的全喉框架。研究结果表明，通过14h去细胞灌注处理后，全喉大体结构完整，喉组织颜色苍白透明，体积无明显变化，硬度无明显改变，喉的三维结构无明显改变。全喉支架去细胞后除软骨组织中的细胞外，其他组织如肌肉，黏膜，腺体等细胞成份基本去除，去细胞彻底，效果明显。细胞外的基质成份整保留，组织结构清楚，层次分明。全喉细胞外基质成份之间的网状连接依然存在，胶原束和细胞外基质成份组成的不规则腔隙存在于喉的会厌，声带，环状软骨，甲状软骨等表面。PCR实验结果显示，不含软骨成份的去细胞支架中几乎无GAPDH基因的扩增，而含软骨成份的去细胞软骨支架GAPDH基因的扩增远低于正常喉组织GAPDH基因的扩增。去细胞后甲状软骨、环状软骨中细胞活性并未见明显变化，组织绝大多数细胞处于成活状态。去细胞全喉基质成份MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ染色阴性。将去细胞支架植入同种异体受体动物大网膜中，可见去细胞喉支架埋植体内后并未引起明显的免疫排斥反应。至各观察时间点取出包埋的喉支架发现，去细胞喉支架仅被薄层的大网膜包裹，未见明显的急性或慢性炎性反应。去细胞喉支架埋植体内4周后可见新生血管形成和成纤维样细胞增生。将培养的第3代的骨髓间充质干细胞（CD29，CD44表达阳性），经过DM-DIl标记后，种植到支架上，可见细胞分散在支架表面，组织学可见细胞主要生长于喉支架的内侧和外侧表面，细胞生长状态良好，分布均匀。扫描电镜结果显示，骨髓间充质干细胞种植到支架上3天可见少量细胞在支架上生长，相互之间伸出胞突，5天后可见细胞成片状分布在支架表面，7天后，支架表面形成了一层膜状结构，铺满整个支架。该研究建立了去细胞全喉软骨支架的构建方法，明确了该支架的免疫原性，生物力学性能和组织相容性，利用骨髓间充质干细胞构建了由异体软骨三维框架与自体细胞组合而成的全喉框架，为构建组织工程全喉提供了实验依据。