二价金属离子转运体DMT1参与阿尔茨海默病发病的分子机制研究

DMT1是参与维持二价金属离子稳态的重要蛋白之一，可能参与神经退行性疾病的发生。在前期研究工作中，我们已获得DMT1与AD病理过程相关的重要证据，但研究尚不深入。为探讨DMT1参与AD发病的分子机制，本项目首先在前期对稳定表达APPsw的SH-SY5Y细胞进行DMT1基因沉默获得有价值证据的基础上，拟构建双转染人DMT1和APPsw基因的SH-SY5Y为研究对象，在分子水平检测Aβ形成各环节的变化，从knock-in和knock-down两方面分析DMT1参与APP表达和酶切加工及Aβ分泌的可能机制。再通过繁育DMT1功能缺失的AD模型小鼠，通过形态学和分子生物学等多种技术手段检测APP、β-分泌酶、γ-分泌酶的表达以及Aβ分泌和Tau蛋白磷酸化的变化，验证DMT1导致Aβ沉积和NFT形成的确切环节和机制。本项目及相关前期研究将为揭示DMT1参与AD发病机制奠定充分的实验基础。

目前，越来越多的证据显示Aβ寡聚体可能是造成AD患者早期记忆缺失及神经元死亡的主要神经毒性物质。研究证实DMT1是参与神经退行性疾病的重要相关蛋白，本项目拟通过编码DMT1蛋白的slc11a2基因突变小鼠 (纯合子mk/mk，杂合子mk/+) 证实抑制DMT1功能可以有效拮抗Aβ寡聚体的毒性，保护神经元，从而减轻AD相关的病理进程。我们将实验动物侧脑室注射Aβ1-42寡聚体，通过行为学检测，我们发现DMT1基因突变小鼠在穿梭平台时间、路程以及次数上均优于野生型小鼠。神经元形态和功能检测结果表明与野生对照组小鼠相比，DMT1基因突变小鼠接受Aβ寡聚体注射后海马CA1、CA3和DG区域的神经元形态较完整，数量也较多，凋亡细胞相对较少，Caspase-3表达上调的水平最不显著，NMDAR1 (NR1) 和突触后致密物蛋白95 (PSD95) 表达下降程度较轻，说明Aβ寡聚体对DMT1基因突变小鼠神经元、NR1和PSD95的损伤程度最低。综上，动物实验表明Aβ寡聚体侧脑室注射能引起小鼠行为学异常和海马神经元死亡，但slc11a2基因突变对Aβ寡聚体侧脑室注射引起的学习记忆能力下降、神经元死亡和NMDA受体表达量减少具有保护作用。.以神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞作为体外研究对象，应用Ferristatin和siRNA抑制SH-SY5Y细胞的DMT1功能后发现，Ferristatin和DMT1 siRNA的作用使Aβ寡聚体对SH-SY5Y细胞的毒性作用相应降低，Caspase-3表达上调受到抑制。并且 Ferristatin和DMT1 siRNA能有效拮抗Aβ寡聚体引起的NR1、PSD95和突触素Syn表达水平的下降。随后，我们利用转染人APPsw基因和空质粒neo的SH-SY5Y细胞作为研究对象，通过Ferristatin和siRNA阻断DMT1功能进而研究APP processing过程中相关蛋白的变化。我们发现Ferristatin和siRNA能降低APPsw细胞的BACE1、PS1、sAPPβ和C99表达，增加ADAM10和sAPPα和C83表达。综上，细胞实验提示干扰DMT1功能能够拮抗Aβ寡聚体引起的神经元损伤和突触功能异常，并能够抑制APP淀粉样蛋白代谢途径，促进APP非淀粉样蛋白代谢途径。