ATP7B基因剪接突变调控COMMD1介导的ATP7B泛素化修饰在肝豆状核变性中的致病作用及其机制研究

Hepatolenticular degeneration, an autosomal recessive genetic disease characterized by copper metabolism disorder, mainly caused by the dysfunction of mutant ATP7B variants. COMMD1 plays an important role in the regulation of ATP7B function, but the exact molecular mechanism is still unknown. Our previous studies indicated that the third exon of ATP7B gene might involved in the regulation rules of COMMD1. Therefore, this project attempts to focus on the splicing mutations c.1286-2A>G and c.1543+1G>C, which both affect the alternative splicing of ATP7B exon 3. We use in vitro transcription assay to confirm the novel ATP7B variants that generated by these splicing mutations, followed by the exploration of the mutant variants’ function in both cell line and animal models. Co-IP will be performed to detect the protein-protein interactions between wild-type/mutant ATP7B and COMMD1 in HepG2 cells co-cultured with different concentrations of CuCl2 solution, and the ubiquitination site of ATP7B will be detected. Besides, Co-IP-MS will be used to search for the specific E3 ubiquitin ligases and other potential interacting proteins of ATP7B. This project will reveal the molecular mechanisms of hepatolenticular degeneration that caused by ATP7B splicing mutations, mainly through regulating the COMMD1-mediated ubiquitination of ATP7B, and provide valuable information for the diagnosis and prognosis.

肝豆状核变性是以铜代谢障碍为特征的常染色体隐性遗传疾病，ATP7B基因突变导致的蛋白功能缺陷是其最主要的致病因素。COMMD1对ATP7B正常功能的发挥有着重要的调控作用，但具体的分子机制仍不明确。课题组前期发现，ATP7B基因3号外显子可能与COMMD1的调控相关。因此，本项目拟针对影响该外显子的剪接突变c.1286-2A>G、c.1543+1G>C，以体外转录实验确认其造成的ATP7B基因剪接改变，同时在体内及体外模型中观察突变造成的蛋白功能变化。以Co-IP检测不同铜离子浓度下野生型及突变型ATP7B与COMMD1之间相互作用的差异，并鉴定ATP7B的泛素化位点。利用质谱搜索并验证特异的泛素连接酶及其它潜在的相互作用蛋白。本研究旨在揭示3号外显子的剪接突变通过影响COMMD1诱导的ATP7B泛素化而导致肝豆状核变性的分子机制，为临床疾病诊断及判断病情严重程度提供有价值的参考信息。

肝豆状核变性是以铜代谢障碍为特征的常染色体隐性遗传疾病，ATP7B基因突变导致的蛋白功能缺陷是其最主要的致病因素。本项目选取影响ATP7B基因3号外显子的剪接突变c.1286-2A>G、c.1543+1G>C为研究对象，探索其对ATP7B蛋白功能的影响机制。本项目首先确认了剪接突变对ATP7B基因3号外显子可变剪接的实际调控作用，即c.1543+1G>C突变可造成3号外显子在成熟mRNA中完全丢失，产生缺少3号外显子的突变型ATP7B。对突变型ATP7B蛋白序列进行蛋白结构分析，可知3号外显子的缺失可造成蛋白三级结构的显著变化，这可能是其功能改变的结构基础。在Huh7细胞中分别表达野生及突变型ATP7B，在高铜环境的刺激下，表达野生型ATP7B的细胞中铜离子含量显著减少，细胞生存率增加，而表达突变型ATP7B的细胞相比于对照组则无明显差异。免疫荧光显示，突变型ATP7B的亚细胞定位发生变化，在高铜环境中无法转位至细胞膜上，是其无法发挥铜转运功能的原因之一。另一方面，野生型与突变型ATP7B的相互作用蛋白网络存在明显差异。Co-IP结果显示，高铜环境下突变型ATP7B与COMMD1间的相互作用显著增强，COMMD1介导的ATP7B泛素化修饰可能是影响ATP7B突变体稳定性及蛋白定位的重要因素。通过构建ATP7B敲除的转基因小鼠，本项目还在体内对ATP7B突变体的功能进行了评估。给予腺病毒包装的ATP7B基因片段表达载体后，小鼠肝脏中的铜离子蓄积得到明显改善，而突变型ATP7B则无法清除肝脏中的铜离子。因此，本项目针对ATP7B基因3号外显子的剪接突变，阐明了其导致ATP7B剪接异常的调控机制，并在细胞及转基因小鼠两个层面上探究了突变型ATP7B的功能改变及可能的分子机制，为临床ATP7B基因突变致病性的判断提供了实验依据。