同位素标记实验考察脱氮假单胞菌的甜菜碱代谢机制与微观代谢通量分析

Betaine has significant effect on vitamin B12 production by Pseudomonas denitrification, however, the metabolic mechanism can hardly be clarified from the current theoretical point of genetic, enzymatic and fermentation environmental researches. Hence, we will elucidate the metabolic mechanism of betaine by feeding isotope-labeled betaine. Combined with the intermediate metabolites labeling patterns measured by GC/MS and LC/MS and the statistic principles of publicly available software FiatFlux and 13C-Flux,the metabolic flux ratios and distribution were obtained in combination with enzyme activities and mRNA expression. Firstly, we use specific 13C-labeled betaine for experimental elucidation of the fate and metabolism of betaine in cell growth and vitamin B12 biosynthesis period, and construct the metabolic network topology include betaine metabolism. Secondly, the experiments based on combination of various labeled glucose and betaine were carried out for illustrating the mechanism of respiratory metabolism、central carbon metabolism and vitamin B12 biosynthesis affected by betaine. These will be great important for revealing the battleneck further metabolic controlling in in vitamin B12 production.

甜菜碱对脱氮假单胞菌维生素B12生产过程影响显著，然而其代谢机理很难通过已有的在基因、酶学和发酵环境代谢组上的研究结论进行阐明。本课题将通过在发酵过程中补加13C标记底物甜菜碱的代谢考察实验，在利用13C同位素代谢软件FiatFlux和13C-FLUX理论进行GC/MS和LC/MS数据分析的基础上，结合酶活和mRNA数据阐明甜菜碱在工业VB12发酵过程中的代谢机制。首先通过以特定标记的甜菜碱进行代谢实验，阐明甜菜碱在菌体生长期和产物合成期的分解代谢去向和代谢机制，构建代谢途径网络；然后根据不同13C标记模式的葡萄糖和甜菜碱组合实验，阐明甜菜碱对生产菌中心碳代谢和维生素B12合成代谢的作用机理，其对VB12生物合成代谢途径中的瓶颈节点及代谢调控具有重大意义。该方法对其它工业发酵过程底物代谢的研究也具有很好的借鉴作用。

提高工业维生素B12发酵过程中脱氮假单胞菌的基质转化效率，降低原材料的消耗成本，是我国VB12发酵生产过程面临的巨大难题。本课题组在研究中还发现，甜菜碱对生产菌的呼吸代谢（比氧摄取率、比二氧化碳生成速率和呼吸商）和底物葡萄糖的转化率影响显著，甜菜碱在实际生产中的消耗量远大于其作为产物合成甲基供体理论需求量，这种现象很难由现有的结论观点进行合理解释。占整个原材料消耗成本43%以上的的甜菜碱消耗以及其引起的底物葡萄糖异常消耗代谢，严重影响VB12的生产成本和市场竞争力。这些问题的解决亟待从胞内代谢流的角度去分析现象的本质，阐明甜菜碱在脱氮假单胞菌发酵生产VB12胞内代谢去向、以及对葡萄糖碳代谢途径变化与VB12合成代谢之间的关系和作用机理，是进一步对胞内微观代谢途径通量变化进行有效调控和工业发酵生产工艺优化的关键。.因此本项目以工业生产菌脱氮假单胞菌为对象，利用特定13C标记的甜菜碱和葡萄糖底物，进行同位素代谢实验，根据代谢网络中中间代谢物碳原子标记丰度的变化，考察甜菜碱的代谢去向，通过全局代谢分析，阐明甜菜碱影响碳中心代谢途径和产物合成途径通量变化的机理，为该菌的代谢调控和工业生产工艺的优化提供指导方向。.利用胞内代谢物同位素标记丰度检测方法，通过标记实验证实了C4途径是脱氮假单胞菌VB12前体5-ALA合成的主要途径。并根据建立的微观代谢网络模型及宏观动力学分析阐明了甜菜碱对胞内中心碳代谢和产物释放机制影响，并结合优化的甜菜碱控制浓度下的比氧消耗速率的控制优化了生产新工艺，达到了产物对甜菜碱的得率系数由11.9mg/g增加到了17.2mg/g，并大幅度提升了菌体生长和提高VB12的合成速率，及对合成和向胞外释放的抑制作用，发酵周期缩短了14.3%。 该课题得到的相关机理对于指导工业工业维生素B12发酵过程中甜菜碱的流加控制工艺，提升生产效率起到了重大指导作用，同时微观同位素标记代谢研究发现的C4为主的代谢途径鉴定为进一步通过基因遗传增强提供