用同位素标记试验考察糖多孢红霉菌的正丙醇代谢机制与微观代谢流分析

Previous macro-metabolic flux analysis indicated that part of propanol went into carbon central metabolic pathways and did not integrate into the erythromycin molecule in the way of precursor . Hence,current study aims to disclose the metabolic pathways of propanol by feeding isotope-labeled sodium propionate at different carbon position. In combination with some relevant enzyme activity assay and mRNA transcription study, the metabolism will be further testified. The flux fraction of relevant pathways will also be calculated. Next, isotope labeling experiments will be conducted on the industrial complex medium for elucidation of the fate of propanol under industrial condition. Meanwhile, the fate of glucose in the network will be also studied as well as its contribution for erythromycin biosynthesis. Finally, the metabolic network will be comprehensively analyzed by a series of isotope labeling experiments with labeled sodium propionate and glucose.The regulation of erythromycin biosynthesis will be elucidated based on micro-metabolic flux analysis under different ratios between glucose and propanol. "Non-targeted tracer fate detection" and "elementary metabolite unit" methods will be applied in the research and results obtained are expected to break up the traditional idea, (i.e. propanol only used as precursors for erythromycin biosynthesis) and provide a brand-new process control strategy, furthermore,to direct strain improvement by metabolic engineering.

前期宏观代谢流计算发现作为红霉素合成前体的正丙醇有很大部分流入碳中心代谢。为了探明正丙醇的真实代谢去向，本课题将通过过程补加碳标记丙酸钠的发酵实验，在GC/MS和LC/MS数据的基础上，结合酶活和mRNA数据阐明正丙醇的代谢途径及途径流量分率，进而采用复合培养基进行标记实验，揭示工业复合培养基下的正丙醇代谢去向。同时，通过流加碳标记葡萄糖的发酵实验，明确葡萄糖的碳原子在糖多孢红霉菌代谢网络中的分布，揭示葡萄糖对红霉素合成的贡献。最后，通过流加标记丙酸钠和标记葡萄糖组合的发酵实验，深层次解析红霉素合成代谢网络，并依据代谢物的同位素标记信息计算不同糖醇比例下的微观代谢流量分布，阐明红霉素合成代谢的调节机制。本课题采用新近提出的"非特定代谢物检测"和"基本代谢单元"算法，实验结果有望打破固有正丙醇只是作为红霉素合成前体的设想并形成全新的红霉素调控策略。同时，将为代谢工程菌种改造提供崭新的思路。

在项目执行期间，课题组完成了计划任务的内容。按照计划任务，课题组优化出了适合于13C代谢通量分析的合成培养基，将合成培养基条件下的糖多孢红霉菌的菌体浓度从1g/L提高到了12g/L，这种改进的后的合成培养适合于糖多孢红霉菌的菌体生长以及13C代谢通量分析；课题组研制了用于13C标记实验的微型生物反应器系统，该微型反应器可以大大节省用于13C标记实验的底物，同时该反应器可以通过计算机自动控制发酵条件，以得到稳定的代谢条件和可靠的代谢数据；课题组构建了完善的13C标记信息分析的实验平台，建立并优化了利用GC-MS测定20种氨基酸标记信息的方法，建立并优化了利用LC-MS/MS测定45种核心碳代谢网络中的中间代谢物以及5种重要的辅酶A类物质的同位素信息的测定方法。利用构建好的13C同位素分析平台，课题完成了对糖多孢红霉菌的代谢通量分析，深入理解糖多孢红霉菌的代谢特点，找到了糖多孢红霉菌的可能存在的代谢靶点，并实现了对这些靶点的代谢改造，构建了相应的基因工程菌。工程菌代谢改造对于红霉素合成的影响还在进一步研究中；为了深入理解红霉素合成的过程，课题组通过高通量筛选技术得到了更多的高产菌株，这些不同的高产菌株具有不同的表型，通过对不同高产菌株的代谢差异的比对，能够使得研究人员更深入理解红霉素合成的过程；结合宏观与微观代谢通量分析，课题组得到了糖多孢红霉菌的代谢特点以及红霉素发酵过程中不同碳源在菌体生长和红霉素合成过程中的转化关系，利用代谢通量分析结论，课题组有针对性地优化了红霉素发酵过程，并成功将红霉素产量提高了20.85%。课题组，利用构建好的13C同位素分析平台对合成β-半乳糖苷酶的酵母菌株进行代谢通量分析，找到了影响β-半乳糖苷酶合成的代谢瓶颈，成功将的β-半乳糖苷酶的产量提高了40%。在进一步研究过程中，课题组将利用构建好的13C同位素标记实验平台对不同表型的红霉素高产菌株进行代谢通量分析，比较它们的代谢差异，找到更多影响红霉素合成的靶点，并进行代谢改造和发酵优化，以进一步提高红霉素产量。