冷诱导RNA结合蛋白对H1N1猪流感病毒复制的影响及分子机制研究

冷诱导RNA结合蛋白（CIRP）是脊椎动物间高度保守的多功能蛋白。申请者首次证实CIRP在体内外参与对病毒感染的早期应答，流感病毒在细胞中的增殖持续抑制CIRP的表达。鉴于CIRP对MAPK和NF-κB 信号通路的有显著的 调节作用，而这两条通路又是流感病毒复制和启始宿主免疫应答必需的，因此，CIRP可能通过这两条信号通路影响病毒复制。本项目拟构建过表达和敲低CIRP基因的细胞模型，采用流式细胞仪、激光共聚焦显微镜及荧光定量PCR、Westhen Blot等技术，测定HINI猪流感病毒（H1N1-SIV）在细胞中的穿入、蛋白合成、病毒滴度及细胞凋亡情况；定量检测MAPK、NF-κB信号传导通路及调控凋亡的关键基因表达水平，研究CIRP对H1N1-SIV复制的影响及其可能的分子机制。

一、项目的背景.冷诱导RNA结合蛋白（cold-induced RNA binding protein, CIRP）是脊椎动物间高度保守的多功能蛋白，在多种生理和病理过程中发挥重要作用。但CIRP在病毒感染中的作用尚不清楚。本研究以H1N1甲型流感病毒为研究对象，探讨CIRP对病毒复制的影响及其作用机制，鉴定CIRP新功能并为流感病毒与机体互作研究提供参考。.二、本研究的主要内容.2.1 检测猪和小鼠CIRP mRNA、H1N1流感病毒的荧光定量PCR方法的建立，以及标化检测结果的稳定内参基因的筛选.2.2 CIRP基因过表达和敲低的BHK-21细胞模型的构建.2.3 CIRP 对H1N1穿入、病毒蛋白合成、病毒滴度的影响.2.4 CIRP 对H1N1感染细胞中NF-κB 和MAPK信号导通路的影响.2.5 H1N1感染的BHK-21细胞中CIRP作用的靶分子筛选.三、重要结果.3.1 CIRP对流感病毒mRNA的稳定性是必需的；.3.2 CIRP通过激活NF-кB信号通路促进流感病毒的增殖。.四、关键数据及其科学意义.4.1 流感病毒感染CIRP+ BHK-21后15 h和21 h，病毒荷载量分别为对照组的167%和235%，证明过表达CIRP能显著促进病毒复制；.4.2 过表达CIRP显著促进了BHK-21中NF-κB的磷酸化水平；而阻断NF-κB信号通路后15 h、21 h时，试验组细胞中的病毒滴度分别为对照组的19%和7%。证明CIRP通过激活NF-κB信号通路促进甲型流感病毒的复制。.4.3敲低CIRP后:甲型流感病毒NP和M基因mRNA在BHK-21中的相对半衰期由12 h以上分别缩短至7.5 h和8 h；病毒感染后15 h和21 h，试验组病毒M基因mRNA的合成水平仅为对照组的12.4%，7.6%；病毒M基因cRNA和vRNA1、vRNA2的合成分别是对照组的16.9%、5.3%、11.3%；敲低CIRP显著抑制了病毒NP基因cRNA和vRNA1、vRNA2的合成，试验组中的合成水平分别是对照组的5.1%、2.2%、2.6%；病毒滴度试验组为对照组的1.7%。证明CIRP对维持甲型流感病毒mRNA稳定性和病毒复制是必需的。.4.4利用免疫共沉淀结合质谱技术，筛选到流感病毒感染BHK-21细胞中CIRP的候选靶蛋白29种。