研究嗜冷甲烷叶菌R15膜蛋白质的二维荧光差异表达系统的建立

本项目拟建立二维荧光差异表达系统（2D DIGE）研究Methanolobus psychrophilic R15膜蛋白的分离方案，嗜冷甲烷古菌膜蛋白的2D DIGE方案的优化和建立，可以为其它极端环境微生物尤其嗜冷菌膜蛋白的2D DIGE研究提供有价值的参考。在Typhoon trio采集三色标记的荧光图像后，利用Decyder软件分析该菌在不同温度下膜蛋白的表达差异，采用MALDI-TOF/TOF鉴定蛋白，寻找低温下产甲烷的关键膜蛋白，有利于充分认识其在低温厌氧消化中的作用和影响，为调控低温厌氧消化提供技术支持。R15是在青藏高原湿地中分离的一株嗜冷甲烷古菌新种，为目前国内外第二个能培养的嗜冷甲烷菌，研究其低温下产甲烷的机理，有助于了解湿地甲烷释放的途径及其冷适应的代谢机制，为充分利用功能低温甲烷古菌的资源，实现废弃物资源循环利用，，促进我国农业经济、能源建设和生态发展。

冷适应产甲烷菌有利于寒冷地区的沼气产生，而古菌的冷适应机制却难以琢磨。Methanolobus psychrophilus R15是一株自青藏高原湿地分离的冷适应产甲烷生物，分离时，可以在0–25 °C生长，最适温度18°C；然而，在18°C培养几年后，它在30°C也可以生长迅速。为获得参与最佳生长和冷适应的蛋白质组，我们首先优化了R15的2D DIGE分离方案；分别对在30°C、18°C和4°C下生长的R15蛋白质组进行了比较研究。从整体蛋白的表达模式来看，30℃和18℃更为接近，与4℃表达差异较大。本研究共检测到1439个蛋白点（R15基因组预测有3167个ORFs），322个差异表达蛋白中的202个通过MALDI-TOF/TOF鉴定。大多数参与产甲烷、能量守恒和中枢代谢的酶在30°C时表达增加，而大多数核糖体蛋白表达下降。蛋白酶体和ROS清除剂在4°C时表达增加，表明低温下形成了更多异常的蛋白质和ROS。从伴侣蛋白的角度来看，30℃的高温中R15虽然可以生长得很好，但是却与4℃的低温一样，实际处于一种胁迫状态。表明R15虽然可以在高于其生长环境的温度生长，却是处于一种胁迫状态。与Methanococcoides burtonii冷适应不同的是，一些分子伴侣在4°C时表达增加，暗示该嗜冷古菌在低温下蛋白折叠过程受到损害。本研究表明，不同的产甲烷古菌具有多样的耐低温机制。综上所述，从蛋白组学的角度我们提出，R15不是嗜冷而只是适应低温。