三氧化二砷对急性早幼粒细胞白血病WNT信号通路组蛋白和DNA甲基化修饰调控及其机制研究

Modification and its mechanism of arsenic trioxide on acute promyelocytic leukemia WNT signaling pathway histone methylation and DNA methylation Histone methylation and DNA methylation abnormalities may be related to the pathogenesis and prognosis of acute promyelocytic leukemia (APL) ,which is closely associated with arsenic trioxide (As2O3) on the regulation of histone and DNA methylation, the potential mechanism for the treatment of APL. The primary aim of this research project is to explore the possible mechanism of the treatment of APL by arsenic trioxide. To further elucidating this subject ,APL cell strain NB4 was used as study object, and the the abnormal methylation of the Wnt signaling pathway in NB4 cells suppressor gene as a target which preliminary studies have confirmed .We intend to clarify it from the modified regulation of histone methylation and DNA methylation on the epigenetics perspective. Total protein level changes of APL histone H3K9 methylation caused by As2O3 is analysed by Western blot ; chromatin immunoprecipitation detect histone H3K9 single, two, three methylation levels of target gene promoter region;heavy bisulfite sequencing detect the role of As2O3 on the regulation of the inhibition of DNA methylation under WNT pathway suppressor gene ; and through the histone methyltransferase enzyme / histone demethyltransferase enzymes and DNA methyltransferase expression detections analyse of the possible mechanism of As2O3 affecting WNT pathway suppressor gene histone H3K9 and DNA methylation.

组蛋白和DNA甲基化修饰异常可能与急性早幼粒细胞白血病（APL）的发病及预后密切相关。三氧化二砷（As2O3）对组蛋白和DNA的甲基化修饰调控可能是其治疗APL的机制之一。课题拟以APL细胞株NB4为研究对象，以前期研究证实在NB4细胞中发生异常甲基化的Wnt信号通路抑制基因为靶点，从组蛋白甲基化修饰调控及DNA甲基化修饰调控的表观遗传学层面探讨三氧化二砷治疗APL的可能的作用机制。通过Western blot技术检测As2O3对APL细胞组蛋白H3K9甲基化的总的蛋白水平的变化；采用染色质免疫共沉淀法检测靶基因启动子区组蛋白H3K9单、二、三甲基化水平变化；采用重亚硫酸氢盐测序法检测As2O3对WNT通路抑制基因DNA甲基化的调控；并通过对组蛋白甲基转移酶/组蛋白去甲基转移酶和DNA甲基转移酶的表达检测分析As2O3影响WNT通路抑制基因组蛋白H3K9和DNA甲基化可能的作用机制。

组蛋白和DNA甲基化修饰异常可能与急性早幼粒细胞白血病（APL）的发病及预后密切相关。三氧化二砷（As2O3）对组蛋白和DNA的甲基化修饰调控可能是其治疗APL的机制之一。. 本项目组利用APL细胞株NB4,检测三氧化二砷作用前后NB4细胞组蛋白H3K9甲基化变化；WNT信号通路抑制基因WIF-1、SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5、DDK3、HDPR1启动子区组蛋白H3K9单甲基化、二甲基化和三甲基化的水平。定量分析不同实验组上述基因DNA启动子区甲基化水平的变化。以组蛋白甲基转移酶SUV39a、组蛋白甲基转移酶G9a、组蛋白去甲基化转移酶JMJD2A、JMJD2B、JMJD2C和JMJD2D;以及DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B为研究目标，分析三氧化二砷用药NB4细胞前后对上述酶的mRNA和蛋白的表达调控;对上述WNT/β-catenin信号通路抑制基因及WNT信号转导通路重要调节蛋白β-catenin以及WNT信号通路下游重要靶基因Survivin基因，cyclin-D1基因和C-myc基因的表达影响。. 研究结果表明不同浓度As203 作用NB4的细胞后，NB4细胞增殖抑制率和凋亡女随时间和浓度增加而显著升高。WIF-1、DDK3、DPR1、SFRP1, SFRP2, SFRP4, SFRP5基因启动子区的组蛋白H3K9me3均有不同程度的下降，以HDPR1基因明显；而H3K9me1,2不受影响。WIF-1、DDK3、HDPR1、SFRP1,SFRP2,SFRP4,SFRP5基因甲基化程度明显减弱，H3K9组蛋白甲基转移酶SUV39a、G9a的mRNA相对表达量下降，其中G9a mRNA的下调最为明显；同时H3K9组蛋白去甲基化转移酶JMJD2D mRNA的表达上调， 而JMJD2A、JMJD2B、JMJD2C表达不受影响。DNA甲基转移酶DNMTl、DNMT3A、DNMT3B的表达下降。β-catenin、survivin、c-myc和cyclin-D1表达下降，与未处理组细胞相比差异有统计学意义。 . 本研究证实三氧化二砷能够影响APL细胞组蛋白甲基化和去甲基化酶以及DNA甲基化酶的表达，对WNT/β-catenin信号通路抑制基因组蛋白和DNA甲基化水平进行调控而发挥抗肿瘤作用。