靶向AKT激酶的2-嘧啶-5-酰胺基噻唑类小分子抑制剂及其抗瘤作用研究

AKT在许多人类肿瘤中处于过度激活状态，且AKT的异常活化与肿瘤的发生发展、治疗与预后密切相关，因此AKT是很好的抗肿瘤靶标。我们根据AKT的ATP结合位点，设计合成了30种2-嘧啶-5-酰胺基噻唑类化合物，并用高通量AKT1激酶活性分析法筛选出4种化合物能在体外显著抑制AKT1的活性。本课题将研究这4种抑制剂对多种AKT过度激活的肿瘤细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用，以及此作用对AKT活性的依赖性；研究它们在细胞内通过靶向于AKT并抑制其下游靶蛋白GSK3β,mTOR,FKHR,FKHRL1的磷酸化，促使FKHR蛋白移位至胞核来发挥抗瘤作用的分子机制，及对其它靶向药物/放疗的增敏作用；研究它们对小鼠的急性毒性作用，以及单用或联合用药对AKT过度激活的肿瘤细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用。最后从中找出1-2个对AKT抑制作用强，具有良好抗内外抗瘤作用且毒性低的抑制剂，为将其开发成新靶点药物打下基础

AKT在许多人类肿瘤中处于过度激活状态，且AKT的异常活化与肿瘤的发生发展、治疗与预后密切相关，因此AKT是很好的抗肿瘤靶标。我们自主研发出靶向AKT的ATP结合位点的小分子抑制剂——2-嘧啶-5-酰胺基噻唑类化合物，并申请了国内专利。经在体外用高通量AKT1激酶活性分析试剂盒筛选，我们从30种抑制剂中筛选出化合物 DC120, DC828, DC829, DC844, DC885在体外能显著抑制AKT1激酶的活性。进一步的细胞毒实验显示，DC120对肿瘤细胞的杀伤作用最强，且荧光共振能量转移实验以及激酶谱抑制测定结果亦表明DC120能特异性地抑制AKT1激酶的活性。于是我们重点探讨了DC120体内、外抗肿瘤药效及抗瘤分子机制的研究。结果如下：（1）体外药效结果显示，DC120能显著抑制多种AKT活性高的肿瘤细胞及鼻咽癌干细胞的增殖，呈现剂量效应关系，并通过诱导细胞发生凋亡来发挥其细胞毒作用；DC120在肿瘤细胞内能通过抑制Akt的活性并使其底物蛋白GSK-3β、mTOR、FKHR、FKHRL1、PRAS40去磷酸化，促使FKHR蛋白由胞浆移位至胞核，从而阻断其下游途径并启动细胞凋亡的进程。（2）体内药效结果显示，DC120在20mg/kg/d剂量下能显著抑制CNE2和Bel7402裸鼠移植瘤的生长而无明显毒副作用，能在体内阻断Akt下游信号传导通路，从而诱导细胞发生凋亡。（3）在联合用药研究中，发现DC120时间及浓度依赖性地激活mTORC1激酶的活性及MAPK信号通路；mTORC1抑制剂RAD001能增加DC120诱导凋亡的敏感性；MEK特异性抑制剂U0126亦能明显增加DC120诱导凋亡的敏感性，10mg/kg DC120 与20mg/kg U0126联用协同抑制Bel7402裸鼠移植瘤肿瘤生长；若将DC120、U0126及RAD001合用，发现三者协同诱导细胞凋亡，效果优于任意两个合用。本研究证实DC120具有良好内外抗瘤作用且毒性低，为将其开发成新靶点药物打下基础。. 另外，我们发现激活的Akt可通过GSK3β/β-catenin/LEF-1途径上调Mre11的表达，增强肿瘤细胞对低剂量放射线诱导的DSB的修复能力。该研究为探讨AKT在DNA损伤修复系统中的作用奠定基础，为未来研发靶向AKT和DNA损伤修复通路的药物，增强肿瘤细胞对放化疗敏感性提供依据