通过全长RNA测序研究可变剪接在扩张型心肌病中的功能

Dilated cardiomyopathy (DCM) is a common disease of the heart muscle in which the left ventricle is enlarged and its ability to pump blood is impaired. It is one of the leading causes of heart failure. Mutations in approximately 30 genes have been shown to cause DCM, and some of the most severe cases involve problems with the alternative ways in which RNA transcripts are spliced in the heart. It has shown the mutation in an RNA binding protein, is related to alternative splicing in heart functional genes in DCM patient. It is not clear how transcript isoform expression is regulated in dilated cardiomyopathy. By developing Transcript isoform sequencing (TIF-Seq) to reconstruct the transcriptome architecture of a genome by identifying the precise start and end sites of all transcript isoforms, we demonstrated a far more complex transcript isoform variations than expected. Applying novel technologies capable of long-read sequencing, full transcript isoforms will be identified, quantified and compared in heart tissue derived from healthy individuals and DCM patients. DCM patient mutations associated with splicing defects will be engineered in heart cells derived from adult individuals (iPSC-cardiomyocytes), where their effects on splicing will be directly and quantitatively compared. This will enable the determination of which mutations cause which splicing defects. These mechanistic insights will elucidate the development of different DCM cases, build an improved molecular and mechanistic understanding of DCM, and pave the way towards precision molecular diagnostic and early therapeutic application.

扩张型心肌病是一种常见心肌疾病，多表现为左心室扩大，收缩泵血能力受损，是导致充血性心力衰竭的主因之一。多项研究表明30余个基因的突变可引起此疾病，其中部分基因调控RNA的可变剪接，其产生的不同RNA转录异构体和多种心肌细胞功能异常密切相关。但RNA转录异构体在该病的发病机制中的具体作用尚不明确。项目组在此前的研究中利用转录组起始终止位点测序，发现了RNA转录异构体在细胞内具有多样性和功能复杂性。在此基础上，项目组拟采用正在研发的全长转录组测序技术，对患者心肌细胞以及通过人工诱导多能干细胞技术引入不同致病基因突变的心肌细胞进行全长RNA转录异构体定量测定和比较，研究多个致病突变与不同剪接缺陷之间的对应联系。本研究将揭示不同基因突变通过可变剪切异常引起扩张型心脏病的分子机制，为精准的分子诊断和早期治疗提供理论基础。

扩张型心肌病是一种常见心肌疾病，多表现为心脏功能减弱、心室扩大、收缩泵血能力受损，是导致充血性心力衰竭的主因之一。扩张型心肌病的发生与遗传有关，研究发现30多个基因的突变与心肌病的发生有关，其中包括RBM20，一个编码可变剪切调控的基因。RBM20多个位点的突变如何影响心肌细胞的基因发生可变剪切及在疾病发生中的作用需要深入研究。本项目利用三代单分子测序技术，对通过人工诱导多能干细胞衍生的野生型心肌细胞和RBM20致病突变位点基因编辑的突变型心肌细胞进行了全长转录组测序，进而对RBM20的不同致病位点的突变对可变剪切的影响及产生的全长转录组的调控进行了系统研究。首先针对三代测序长读长序列随机错误率高，我们建立了基于剪切位点对原始读长进行聚类，进而对全长转录本进行定性定量的统计分析方法FulQuant（full-length transcript quantification）。我们利用外源RNA转录本标准品作为金标准，验证了FulQuant的准确度高达97.6%，在低于2000bp的RNA转录本的鉴定更是达到了100%。FulQuant方法是不依赖于已知注释的分析方法，所以可以鉴定出已知注释中没有的全新的转录本。在心肌细胞的转录本中，一共检测到5740个全新的转录本，占所有转录本的15.6%。为研究RBM20突变位点造成的影响，我们通过比较分析鉴定到了在RBM20突变后差异表达的107 个基因，这些基因在横纹肌发育、心脏收缩的调节、离子转运等过程中起作用，反映出RBM20在心脏功能中重要的调节作用。同时，这些差异基因并不是所有的转录本都差异表达，而多是少数几个转录本差异。例如，线粒体内膜蛋白编码基因IMMT共有5个转录本，其中三个转录本没有显著变化，但是两个已知注释没有的全新的转录本存在显著变化。通过功能域分析，我们发现这两个新转录本32个氨基酸的缺失破坏了野生蛋白中的卷曲螺旋结构域。新IMMT转录本的功能变化可能与心肌病的发生有关，同时也说明了不依赖于注释的全长转录组识别和鉴定方法的重要性。我们通过全长RNA测序研究了多个致病突变导致的不同可变剪接差生的不同转录本的差异表达，揭示了不同基因突变位点通过可变剪切异常引起扩张型心脏病的潜在分子机制，为精准的分子诊断和早期治疗提供了理论基础。