基于体外模型的耐受性核酸的消化吸收研究

The project will study on the digestion and uptake of tolerant nucleic acids which are difficult to hydrolyze totally based on the in vitro model. Pure nucleic acids and food with higher nucleic acids are selected as research materials. Digestion enzyme and other biochemistry conditions will be tested to set up an in vitro digestion model which fits for edible nucleic acids. The digestion rule of nucleic acids and the characteristics of degradation products will be studied using this in vitro digestion model. Then the tolerant nucleic acids which show some resistance to digestion will be figured out. After that, digestion tolerant nucleic acids will be applied to Caco-2 cell model to investigate their intestine uptake. Their in vivo stability will also be studied using blood and lymph. The results will help us to find out that oligonucleotides with what kind of structures or sequences can survive from in vivo conditions and be uptaken by intestine. The conclusions of the research will also provide a basis for the possibilities of tolerant nucleic acid enter into human tissues or cells..The shining points of our project are: (1) In vitro model is creatively introduced in the edible nucleic acids research. It is a brand new way and brings dawn to nucleic acids research. (2) Tolerant nucleic acids which may still show their physiological functions will be focused for the first time. Their characteristics of digestion process, structure, uptake and in vivo stability will be studied systemically. Our research will offer technical support and theoretical evidence for nutrition and safety of nucleic acids utilization, such as genetically modified food, gene drug, gene therapy, etc.

本课题将以体外模型为基础，从难于完全分解的耐受性核酸的角度研究食用核酸类物质的消化、吸收情况。课题将以单一纯核酸化合物及核酸含量较高的食材作为原材料，采用适当消化酶和生化条件，建立适用于食用核酸类成分的体外消化模型，利用其分析核酸消化降解规律和产物特点，探寻确定难于完全降解的消化耐受性核酸。主要消化耐受性核酸以Caco-2细胞模型研究其肠吸收情况，以人体血液和淋巴液为基质，研究其体液中的稳定性，以评价何种结构或状态的寡核苷酸可以在体内环境下"幸存"并吸收，为耐受性核酸在体内留存并进入组织和细胞的可能性提供依据。.课题创新之处在于：(1)将创造性的把体外模型引入食用核酸的研究中，为核酸研究另辟蹊径；(2)将首次针对可能尚有遗传表达生理功能的耐受性核酸，对其产生机制、结构特点、吸收特性及稳定性进行较系统研究。成果将对核酸摄入营养、安全，转基因食品、基因药物等核酸利用，提供技术支持和理论依据。

该项目以构建体外模型研究耐受性核酸的消化、特征、吸收为目标，在3年的工作中意外发现核酸可以在胃中被消化，并且这种消化作用主要来源于胃蛋白酶（pepsin），更正了核酸消化从小肠开始的传统观点。通过人胃液、酵母重组表达的pepsin以及其他动物中的pepsin证实了胃蛋白酶的这一新作用，因此将胃部作为体外模型的重要一环。结合唾液对核酸的降解，初步建立了包括口腔和胃部的核酸消化体外模型，口腔部分使用直接提取的人唾液，胃部消化模拟条件为磷酸缓冲液（pH 3.5），180 mM NaCl，4 mg/mL猪pepsin，37 ℃下消化2 h，搅拌转速95 rmp。体外模拟研究了pepsin消化核酸的理化性质，通过特异性抑制剂和部分氨基酸突变型peisin等提出peisin可能将核酸误认做芳香族氨基酸，其活性中心可能与蛋白相同或相关。对pepsin消化后的核酸产物即消化耐受性核酸的特征研究表明，pepsin表现为识别特定核酸序列的核酸内切酶，产物一般为几十个nt长，且具有3’-PO4和5’-OH。同时，该消化被证明与蛋白、盐等其他食品成分密切相关，即饮食习惯将对摄食核酸的消化产生影响。关于核酸在胃中消化的新发现于2015年7月发表。.根据消化耐受性核酸的研究结果，通过Caco-2细胞构建的小肠上皮吸收模型，研究了耐受性核酸的细胞摄取和肠吸收，发现其摄取和转运机制为特异性受体依赖型的主动运输，即单链及双链寡核苷酸均可通过巨胞饮被细胞所摄取，蛋白SR、 TLR9均参与了耐受性核酸的细胞摄取。消化耐受性核酸对肠道微生物生长的研究表明它可以通过促进有益菌生长（双歧杆菌）来抑制有害菌（大肠杆菌），并且这种作用通过寡核苷酸或单核苷酸起作用，核苷、核糖、碱基等次级结构不能发挥作用。.进一步评价了消化耐受性核酸进入细胞或组织中发挥功能的可能性，发现它们在一定时间内可以在细胞质中以完整状态存在，并倾向聚集于细胞核附近，因此有在肠道细胞或微生物中发挥生理功能的可能性。在血清中可被核酸酶降解，因此进入其他器官并发挥作用的可能性降低。.截止目前，本项目资助共发表SCI论文一篇（Nature group，IF>5），中文核心期刊文章3篇，接受2篇，申请专利一项（已受理）。培养博士研究生2名（1名已答辩），硕士研究生4名（2名已答辩），参加国际学术会议三次（发表口头报告2次）。